无创性产前诊断技术应用于21-三体综合征筛查的进展

周奋翮 孙路明

（同济大学附属第一妇婴保健院 上海 200040）

染色体非整倍体异常是一类常见的胎儿遗传性疾病，发病率占出生胎儿的1/300。最常见的非整倍体异常即为21-三体综合征（唐氏综合征），其发生率约为1/800。人们通过不同的筛查方法，希望在孕期能够尽可能的筛查出该病的高危人群。目前常用的筛查方法为早孕期和中孕期筛查，即控制检出率达到90.0%，假阳性率在2.0%～5.0%的情况下，多采取孕妇年龄、胎儿超声检查结合母体血清学指标综合计算得出相应的结果，其结果分为低危和高危[1]。对于高危人群，往往采取绒毛活检或者羊水穿刺取样，进行胎儿染色体核型分析获得确切的结果明确诊断。但无论何种方法，侵入性诊断始终存在约0.5%～1.0%的胎儿丢失率。

随着通过母体外周血获取胎儿细胞方法的逐渐成熟，越来越多的产科医院开始尝试无创的产前诊断方法。自1990年以来，这项技术被人们不断探索并取得长足进展，为遗传性疾病的高危人群提供了一种安全的产前诊断方法。该技术本身也存在一定的问题亟待解决，因此这项技术仍然在不断的完善中，暂未大规模的应用于临床。本文结合最近一段时间文献相关报道的复习，对无创性产前诊断技术应用于筛查21-三体综合征的进展进行讨论。

1 无创性产前诊断技术实验室检测方法的进展

1.1 利用孕妇外周血中胎儿细胞诊断胎儿非整倍体异常

由于孕妇外周血中发现了胎儿细胞，故人们联想到利用孕妇外周血中胎儿细胞诊断胎儿非整倍体异常。如果能够获得完整的胎儿基因组DNA，则可以进行完整的胎儿染色体核型分析，从理论上可以作出这样的推断。困难在于，外周血中发现的胎儿细胞类型多样，主要有滋养细胞、胎儿有核红细胞（NRBC）、淋巴细胞和粒细胞等。相对其他细胞来说，NRBC是单核细胞，寿命短且稳定，增殖能力有限，不滞留到下次妊娠。此外，NRBC有明显的形态学特点和特殊的细胞表面标志物，易于识别，因此被认为是理想的无创伤性产前诊断靶细胞[2]。

影响胎儿细胞应用于临床诊断的因素，首先是获得的胎儿细胞数量太少且存在一定的背景干扰。不但有胎源性，也有母源性。因此，在利用NRBC进行无创性产前诊断时，须对分离到的NRBC来源进行鉴定，以保证结果的准确性。起初常用的方法为FISH技术（即原位荧光免疫杂交）。但人们发现采用FISH方法时，大多数细胞难以进行荧光标记，且判读结果依赖于人工，效率低下，这些因素都影响了孕妇外周血中胎儿NRBC在产前诊断中的应用。现阶段提出可能的改进方法为寻找新的特异性标记物或改进胎儿细胞的收集方法。可以设想，如果孕妇外周血中的胎儿细胞能够培养成功，可以获得足够的应用于核型分析的胎儿细胞，再结合改进的FISH技术，如光谱核型分析可能使得非侵入性产前诊断胎儿非整倍体出现突破性进展。

1.2 利用孕妇血浆中游离胎儿DNA检测胎儿非整倍体异常

有研究发现怀有染色体非整倍体胎儿的孕妇，其血浆或血清中胎儿游离DNA浓度高于怀有正常胎儿的孕妇，但困难的是在孕11～17周，母体的游离DNA占绝对优势，使用传统的DNA提取技术和荧光定量聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)方法难以对胎儿染色体非整倍体异常进行准确诊断。解决这一问题的途径，一种方法是增加提取的胎儿DNA浓度或抑制母体DNA浓度，减少背景DNA；另一种方法是寻找孕妇外周血中新的胎儿特异性标志物，使之不受高浓度母体背景DNA的影响[3]。近年来表观遗传学的研究为这一设想提供了可能，DNA甲基化是最早发现也是最重要的基因表观修饰方式之一。DNA甲基化是在DNA甲基化转移酶的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化调控了基因的表达但并不改变基因的序列。一般情况下，DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。2002年Poon等[4]利用甲基化特异性PCR方法，不仅从母体血浆中检测到了胎儿从父系继承下来的甲基化等位基因，还检测到从母系继承来的胎儿非甲基化等位基因，说明胎儿与母体之间的基因位点上存在不同的甲基化形式。这一结果为无创伤性诊断胎儿非整倍体提供了依据。

Chim等[5]的研究显示，编码maspin基因的SERPINB5基因在胎盘细胞中处于低甲基化，而在母血细胞中处于高甲基化。因为胎盘是血浆中游离胎儿DNA的主要来源，而母血细胞是血浆中母体DNA的主要来源。推测利用胎儿和母血细胞之间存在的DNA甲基化状态的差异，可以进行胎儿非整倍体的检测。唐氏综合征由于其发病率高而备受关注，为了寻找21号染色体的表观遗传标记，Hulten[6]采取了3种策略进行筛选，结果在21q22.3发现了3个差异甲基化序列。其中AIRE基因启动子区域的CpG位点高度差异甲基化，可作为无创性产前诊断唐氏综合征重要的候选表观遗传标记。Chim等[7]采用甲基化敏感的单核甘酸引物延伸和（或）重亚硫酸盐测序的方法，系统性搜寻21号染色体上的甲基化位点，在114个CpG岛中，有22个显示出母体和胎儿间的表观遗传学差异。随着这些表观遗传标记研究的不断深入，有可能使无创伤性产前诊断胎儿染色体非整倍体成为现实。

1.3 利用孕妇血浆中细胞游离胎儿mRNA检测胎儿非整倍体

2000年Poon等[8]在孕有男性胎儿的孕妇血浆中首次检测到Y染色体特异性锌脂蛋白（ZFY）mRNA。此后多项研究证实了孕妇外周血中存在着游离胎儿RNA。它们主要来自于胎盘，在孕妇血浆中含量丰富，具有极好的稳定性，并且与血浆中胎儿的DNA一样，于产后迅速从血浆中清除。据此推断，利用孕妇外周血中游离RNA检测胎儿异常是可行的。选择细胞游离胎儿RNA进行无创伤性产前诊断的主要优势在于基因转录的mRNA的多拷贝性。另一个优势是胎盘表达的特异mRNA种类是母体任何组织都无法表达的，易于检测。与前述的利用表观遗传学差异选择胎儿特异的标记物一样，分析胎盘来源的RNA类似利用胎儿DNA检测Y特异序列或Rh D血型，母体血浆中完全缺乏这种物质，因此检测不受强大的母体DNA背景干扰。

2 临床应用中的相关问题

2.1 无创性产前诊断技术是筛查还是诊断

回答这个问题牵涉到两个方面，即向哪些人群提供这项技术以及如何使用这些技术。是否所有的孕妇都需要在早孕期进行该技术的检查？如果在唐氏筛查高危人群中，是否需要把无创性产前诊断列同有创性介入性诊断一起作为一种选项？影响这些问题的答案受制于多种因素如技术的精确性，可扩展性，实验室检查持续的时间和成本-效益。显然，成本-效益无疑是非常重要的，这也是其中的难点之一。那我们有必要对所有的孕妇提供无创技术吗？

在欧美国家，政府制订的政策为所有妊娠妇女均需要进行唐氏综合征的筛查或诊断。早孕期唐氏筛查的比例在逐渐升高，和中孕期唐氏筛查相比，早孕期筛查有更低的假阳性率。在英国，如果早孕期唐氏筛查风险高于1/150，则该孕妇需要接受侵入性的产前诊断[9]。早孕期筛查同样能够应用于妊娠并发症如子痫前期、胎儿宫内生长受限、胎儿心脏结构异常及其他遗传综合征等。在无创性产前诊断技术的应用过程中，需要超声提供胎儿准确的胎龄及胎儿的数量来确保检查的准确性。在一些唐氏筛查策略非常完善的国家，是否有必要用新的策略来代替现有的筛查方案也值得考虑。

我们把无创性产前诊断技术作为序贯筛查的一部分，还是作为介入性产前诊断技术的替代品？这个问题属于各个国家自主选择的范畴，从全球范围经济效费比（效用/费用的比例）考虑，完全替代现有的筛查方式显然并不可取。从现有的早孕期唐氏筛查方案看，现有的筛查方法是能够有效检测出唐氏综合征的。从筛查的角度看，目前早孕期唐氏筛查的检出率，假阳性率和假阴性率是可以令人接受的。

2.2 经济学因素

无创性产前诊断与侵入性产前诊断之间的关系是目前探讨的热点。无创性产前诊断花费的多少取决于整个卫生系统在唐氏筛查与诊断路径中对于无创性产前诊断作用的认识。在不同的国家，根据不同的特点采取不同的态度。显然，随着技术的发展，无创性产前诊断技术的成本会不断下降，而其检测的精确性会不断提高。

以英国为例，结合最新报道的文献[10]，我们来探讨无创技术在唐氏筛查策略中的作用。在这项研究中，假定的筛查策略是将所有早孕期唐氏筛查高危的妇女都进行无创性产前诊断，如果无创检测发现阳性结果则进行介入性产前诊断。如果以唐氏综合征目前的发病率进行预测，则每50万名孕妇中可能有1 389例唐氏儿出生。以目前英国早孕期唐氏筛查截断值1/150计算，大约13 646名孕妇需要进行无创性产前诊断，其中进行无创检测阳性的1 305名孕妇需要进行绒毛活检术，进行胎儿染色体和性别分析的检查。13名孕妇手术出现流产（以1.0%的胎儿丢失率计算），1 169个唐氏儿能够得到确诊。如果以每个无创性检测需要£ 200，则全部的筛查与诊断费用需要£ 29 700 000。

如果相同的早孕期唐氏筛查截断值下，高危孕妇不做无创性产前诊断，则所有13 646名孕妇均需要进行绒毛活检术，发生流产的孕妇为136名，通过侵入性诊断可以检测出1 181个唐氏儿。全部的费用需要£ 31 800 000。通过该研究发现，采取无创性产前技术后，能够降低正常胎儿因接受有创检测发生流产的风险，换言之，避免了不必要的有创穿刺和流产。

如果将早孕期筛查的截断值提高，则显然会有更多的孕妇需要接受无创性产前诊断，可以有更多的唐氏儿被检测出，但总体的花费需要增加。举例说明，如果筛查的截断值为1/2 000，检出率可以达到98.0%，50万名孕妇中大约94 000名孕妇需要接受无创性产前诊断，大约1 348例唐氏儿可以被检测出。如果每例无创检测费用仍然为£ 200，则总体花费达到£ 46 200 000。如果每例无创的检测费用降低至£ 50，则该筛查方案的费用与目前早唐筛查1/150采取绒毛活检方案的费用基本相似，但流产的风险更低，且有更多唐氏儿（167）能被检测出。

假如，我们放弃目前的早孕期唐氏筛查，全部采取无创性产前诊断技术的话，假设每例检测费用在£ 50，总体的费用甚至比序贯筛查更低。无创技术和早唐筛查相比有更高的检出率（99.0%），该技术有1.0%的假阳性率，约6 300名孕妇需要接受绒毛活检术，约为目前筛查方案需要接受侵入性检测孕妇数目的一半。

直至目前，关于无创技术在产前的适用范围仍然在进一步的讨论中。目前的文献报道中，该技术主要应用于唐氏筛查的高危人群，其中也有假阳性的存在，这显示了有创性产前诊断技术存在的必要性。我们把无创性产前诊断技术视为“高级筛查”，这同时也显示，对于假阴性的存在也是需要引起重视的。目前的研究表明，无创技术的假阴性较低，但目前提供的研究存在一定的局限性，比如，研究的样本量较小，研究对象多集中于唐氏高危孕妇而非普通人群。对于该技术精确性的评判需要进一步的研究。

从健康专业角度考虑，除非该项技术已被证明精确性非常之高，否则不宜在全球进行大范围的推广。但是这样的观点往往并不与孕妇的意见一致。显然在对待无创技术的应用意见上，存在很多的分歧。一项来自英国的报道显示，与专业医生着眼于无创技术的准确性相比，孕妇更加愿意接受其显著的安全性。与此类似的一份美国的研究显示，孕妇对无创技术主要关注的是其安全性（75.0%），关注度远远高于精确性（13.0%）或更早的得知结果（7.0%）[11]。

2.3 伦理方面的讨论

对于无创技术的伦理及社会学讨论目前主要集中在以下方面：孕妇接受无创技术的检测是否经过充分的知情告知，对于终止妊娠数量增加所带来的社会压力等。令人担心的一个问题是，孕妇往往并不清楚这项技术的方法与用途，仅仅简单的认为是一项血液检测。这样类似的问题同样也暴露在唐氏筛查的过程中，随着无创技术的便捷性，终止妊娠也变得更加随意。

目前可以看到的前景是将无创性产前诊断技术引入到已成熟的唐氏筛查系统中。以往孕妇拒绝唐氏筛查和产前诊断的理由往往是担心流产的风险。目前的序贯筛查方案由于侵入性产前诊断技术的风险使得孕妇在选择接受唐氏筛查时，心理存在一定的阻碍。如果该方案降低了流产的风险，孕妇可能不难作出自己的决定。因此，将无创性技术引入到产前筛查中，有助于孕妇的知情决策。另一关键点是对医学专业人员进行教育，以便能够对患者进行正确的咨询和指导。无论哪种筛查方案，无论何种技术，均存在自身的局限性。任何的筛查手段均有假阳性和假阴性的存在，如何让孕妇在现有的条件下酌情选择筛查的方案，在总体人群中切实降低流产的发生，提高唐氏综合征的检出率是我们努力的目标。

2.4 商业因素

就现在开展的这些无创性产前诊断技术，多数是通过商业行为提供的。对于这些新技术，一线临床医生并不十分确切的了解它们适用的最佳人群、检验的成本、以及如何正确的解读实验室报告，但他们却需要承担对患者的咨询。显而易见的是，临床医生可能会过度把握无创技术的适应症。从患者需求的角度看，无创技术由于其特有的优越性，无须过多宣传，患者的接受度会很好。因此，许多供应商把无创性产前诊断作为抓住市场的重要机会。某些公司宣传自己拥有该技术的全部知识产权，但目前法律上的诉讼并不完全支持这样的观点。随着技术的不断发展，法律上的纠纷并不会因此而减少。作为围产医学专业的医生，应尽可能避免商业因素成为筛查策略的考虑因素，应该客观的看待不同公司所提供的技术存在的利与弊。

3 小结

无创性产前诊断技术无疑是一个充满活力的全新的发展方向，近10年来的表现非常夺目。它的飞速发展除了实验室技术的进步以外，临床迫切的需求和转化医学研究的开展也是其发展的主要推动力。然而，该技术要在全球范围内广泛得到推广仍有漫长的道路要走。这项技术取得进展的同时，如何对它的应用范围、技术局限有清晰的认识、如何对患者进行正确的临床指导，有赖于进一步的研究和经验积累。正确有效的咨询能够使患者充分了解各项技术的利弊并选择最有利于自身的方案，并尽力避免商业因素成为临床医生作出决策的干扰。对于一个产前筛查平台所要求达到的终极目标是能够进行高通量的筛查，达到非常高的检出率、很低的假阳性率和假阴性率，尽可能避免对孕妇的损伤，避免正常妊娠的胎儿丢失，能够具有一定的成本效益。在这些方面，无创性产前诊断技术显然具有非常好的前景。

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