单细胞凝胶电泳技术检测DNA损伤的方法及进展

赵琳娜，陈薛钗，钟儒刚

(北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京 100124)

单细胞凝胶电泳技术( single cell gel electrophoresis， SCGE)又称“彗星电泳”(comet assay)，是一种常用的检测DNA损伤的技术。1984年Östling和Johanson首先提出利用凝胶电泳技术来检测单个细胞的DNA损伤，但他们所采用的中性电泳条件仅能检测双链DNA断裂(double-strand breaks,DSB)，这在很大程度上限制了该技术的应用[1]。但在接下来的几十年里，彗星电泳技术得到了飞速的发展，一方面在改变自身实验条件下能够检测到单链、双链DNA的断裂损伤、DNA交联损伤、检测DNA加合物修复的切除位点。另一方面与荧光原位杂交技术相结合，利用不同的探针能够检测到该基因在癌症病理样本DNA中的丰度[3]，很多科研组利用Comet-FISH技术检测到与癌症发生相关的染色体位点[2,4]。由于彗星电泳技术与其他检测DNA损伤技术相比具有灵敏度高、所需样本少、经济、简便、易操作、实验周期短等优点，因此被广泛的应用于遗传毒性试验、环境污染检测和分子流行病学、生态病理学以及DNA损伤修复的基础研究。

1 单细胞凝胶电泳技术的原理

真核细胞内75%～90%的DNA以双螺旋的形式，以组蛋白八聚体为核心形成负超螺旋结构，从而构成核小体。一般情况下，这种超螺旋的结构使得DNA不能自由旋转，但是如果出现DNA断裂时，这种负超螺旋就会松散，环状结构就会从类核的核心伸展开来，形成晕轮。彗星电泳正是应用了DNA的这一特性。利用去污剂破坏细胞膜和核膜，用高浓度盐提取组蛋白，使得DNA残留而形成类核。这时将类核置于电场中电泳，DNA断片即可从类核部位向阳极迁移，形成类似彗星图像一样的拖尾。并且细胞核DNA受损伤越严重，电泳后表现的彗星尾长越长越亮。通过测量有无彗星及彗星尾部的长度、面积或荧光强度等指标，可以对DNA的损伤程度进行定量分析。

2 单细胞凝胶电泳技术的操作

2.1 制备玻片。可采用单层制胶法、双层制胶法或三层制胶法。在应用单层制胶法时，受试细胞混合在无钙镁磷酸缓冲盐溶液(PBS)配制0.5%～1.0%低熔点琼脂糖(LMA)溶液,滴于洁净的玻片上,立即盖上盖玻片,使琼脂糖均匀地敷在载玻片上,置4℃下10 min待琼脂糖冷却变硬,取下盖玻片。在应用三层制胶法时，用1.0%～1.5%的正常熔点琼脂糖(NMA)溶液铺第一层胶，混有受试细胞的低熔点琼脂糖铺第二层胶，最后用低熔点琼脂糖溶液铺第三层胶。而双层制胶法则是在三层制胶法的基础上取消了第三层胶。载玻片的选择上有单面全磨砂载玻片和常规载玻片，磨砂载玻片对胶的附着能力强，但背景荧光强度高，呈现区域样分布，影响后续的图像采集和分析。常规载玻片的背景荧光强度与磨砂载玻片相比较低，没有区域样分布，但是在实验的过程中容易“脱胶”[5]。

2.2 裂解。取下盖玻片,将载玻片立即浸入预冷的裂解液中,4℃下放置1 h以上,使细胞充分裂解,过夜亦可,但时间过长裂解液可能出现沉淀。裂解液是由2.5 M NaCl、100 mM Na2EDTA、 1%肌氨酸钠、10 mM Tris组成,将pH值溶液调至10。临用前加入1% Triton X-100及10%DMSO[6]。但McKelvey-Martin等人在试验中证明裂解液中不加1%肌氨酸钠是没有影响的[7]。

2.3 解旋、电泳和中和。裂解结束后，取出玻片，用去离子水冲洗玻片，然后放置在水平电泳槽中，加入预冷的电泳液(1 M Na2-EDTA,300 Mm NaOH,pH值大于13)。静置20 min,待DNA解螺旋后,以25V 300 mA的条件电泳20 min。电泳完成后取出玻片，置于pH值7.5的0.4 M Tris溶液中中和3次，每次5 min。

2.4 染色、镜检和结果分析。染色时在每张玻片上滴加20～100 μL的荧光染色剂。常用的荧光染料有溴化乙锭(EB)[8]、碘化丙啶(PI)[9]、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)[10]、苯并恶唑啉(YOYO-1)[11]、SYBR Green I[12]gelRed[13]。荧光染料的浓度要适中，浓度过高会使胶板的背景很亮，影响结果分析，相反浓度过低会导致染色不充分，不易观察。并且染色后要尽快检测，时间过长荧光将褪色。为了减少额外的DNA损伤与修复，应在黄光、红光或暗室中进行。1999年Kizilian等改进了银染技术，这种技术不仅提高了彗星电泳的灵敏性，在镜检时不需要荧光显微镜，不用担心荧光淬灭，更重要的是这种方法有利于样品玻片的长期保存。

在荧光显微镜下观察单细胞电泳图像一般放大200～400倍，每个样本随机分析100个细胞。观察指标可分成两类：一类是人工指标，包括彗星发生率、DNA损伤分级计数(从0到Ⅳ分成5个损伤等级)[14]以及一些距离指标(头长、尾长等)，这些指标无需复杂的仪器，便于操作，但结果不精确。第二类是软件分析指标，目前比较常用的指标有Olive等[15]提出的尾矩(Oliv尾矩=从头光密度重心到尾光密度重心的距离与尾部DNA含量的乘积)，以及Arshby等[16]提出的尾矩(尾矩=从彗星头的右边界到彗星尾部末端的距离与尾部DNA含量的乘积)，均能很好地反映DNA损伤的程度。

3 单细胞凝胶电泳技术的改进以及应用范围

3.1 分辨单链DNA断裂和碱性易变位点

为了更好地发挥单细胞凝胶电泳技术的作用，研究者们对其做了多方面的改进来检测不同的DNA损伤。在解旋液和电泳液pH值大于13时，彗星电泳可以检测到SSB、ALS和DNA交联，这个时候展现出来DNA迁移是不能区分两者的。Miyamae等人发现当解旋液和电泳液pH值等于12.1的时候，结果中的DNA迁移仅表现SSB，此时ALS不能表达[17]。所以在pH值大于13条件下DNA迁移比pH值等于12.1有所增加时就表明此时有ALS损伤存在。相反，如果两种条件下的DNA迁移相同，则表明仅存在SSB损伤。

3.2 检测DNA-DNA交联(DNA-DNA crosslinking，DDC)和DNA-蛋白质交联(DNA-Protein crosslinking,DPC)

近几年来，彗星实验也被用于各种环境污染物致 DNA交联作用的检测。目前，国际上比较通用的检测DNA交联作用的彗星实验方法主要有两种：第一种方法是在电泳时加大电压和/或电流或者延长电泳时间。其原理是通过加大电压和/或电流或者延长电泳时间使细胞核内DNA在电场作用下发生明显迁移。 而在交联剂存在时，DNA的碎片附着在一起，从而使迁移率减小，镜下观察表现为彗尾变短尾部面积变小。第二种方法是在所试样本染毒前，先加入标准致断裂剂如甲磺基甲酯[18]、过氧化叔丁醇[19]、H2O2[20]、电离辐射[21]等。其原理是在标准断裂剂作用下使DNA发生断裂，形成很多小的DNA片段，而这些片段在交联剂的作用下附着在一起，从而使迁移率减小。

检测DPC时仅需要在裂解后加入0.5 mM的蛋白酶K 37℃水浴过夜,其余步骤同单细胞凝胶电泳基本操作。蛋白酶K能够消除DNA交联中的DNA-蛋白质交联，因此如果受试样本损害DNA的方式是以DPC为主，那么在没有加入蛋白酶K的实验组中DNA的迁移要比对照组小，而在加入蛋白酶K的实验组中会发现DNA的迁移和对照组是类似的[22]。

3.3 检测DNA加合物

电离辐射、超声波和一些化学试剂并不会对DNA产生直接的危害，而是攻击DNA形成DNA加合物，如果此类DNA加合物不能及时清除和修复，就可能引起DNA突变并导致细胞癌变。 单细胞凝胶电泳技术经过改进后，可以检测到这些DNA加合物。1992年Gedik等人利用UV限定核酸内切酶检测到紫外线诱导Hela细胞产生的嘧啶二聚体[9]。同一时期，Collins等人利用核酸内切酶III检测到DNA加合物氧化嘧啶[23]。1996年他们又发现了利用FPG酶(formamidopyrimidine DNA -glycosylase)能检测到8-OH鸟嘌呤和其他损伤的嘌呤[24]。检测DNA加合物时，DNA裂解后用酶缓冲液(40mM HEPES，0.1M KCl,0.5mM Na2EDTA,0.2 mg/mL牛血清白蛋白)在室温下冲洗3次，每次5 min。完成后加入实验所选择的酶孵育45 min，随后解旋、电泳、镜检。如果检测实验组的彗星尾部强度增加较对照组增加，则表明有DNA加合物的存在。

3.4 利用溴脱氧尿苷标记法检测DNA复制中的断裂

细胞内DNA复制时，本身即会产生一定的DNA断裂，而这将使彗星尾长增加。我们平常所用的彗星电泳的方法不可能辨别出DNA复制时产生的断裂和DNA损伤时产生的断裂，但是如果在DNA复制期间用5溴-2脱氧尿苷(BUdR)来标记细胞，然后用5溴-2脱氧尿苷抗体显色，即可观察到DNA复制时S期所产生的断裂已经标记并出现在彗尾：当DNA复制完成后，5溴-2-脱氧尿苷标记的DNA重新进入彗星头部[25]。

3.5 检测DNA修复过程中的中间产物

彗星电泳图像所显示出的DNA断裂并非完全由于受试药物所致。有些断裂是由于细胞自身切除修复UV诱导损伤或DNA加合物时所生成的核苷酸中间产物。此种断裂通常是时间非常短暂的，特别是在增殖细胞中。当我们把UV照射的细胞和DNA合成抑制剂羟基脲、阿糖胞苷或阿非迪霉素一起培养，将阻断DNA断裂的修复合成，这就会导致切除修复所引发的DNA断裂的积累，通过这种方法，我们可以检测到此类DNA损伤[9]。而在非分裂细胞如外周血淋巴细胞中，由于DNA断裂的再连接的速率受到三磷酸脱氧核苷供应不足的限制，所以即使没用DNA合成抑制剂，也能够观察到此类DNA断裂的积累[26,27]。

3.6 在检测细胞凋亡中的应用

细胞凋亡(Apoptosis) 是指生物体内在特定的内源和外源信号诱导下，其死亡途径被激活，并在有关基因的调控下发生的程序性死亡过程。细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体的DNA降解， 这种降解会形成大量的DSB[28]。因此无论是利用中性电泳还是碱性电泳都可以很轻易地检测出细胞凋亡[29， 30]。凋亡的细胞单细胞凝胶电泳中会呈现独特的“小头扇尾”的形态学特征，而死亡的细胞呈现出“大头长尾”的箭形状态。在镜检的过程中能够迅速准确的区分凋亡和死亡的细胞。

3.7 彗星电泳和荧光原位杂交技术联用

彗星电泳和荧光原位杂交技术联用(Comet-FISH)是由Santos等人于1997年创立的[31]。这种技术在彗星电泳试验的基础上，在解旋和电泳完成后加入了杂交步骤，这样就可以在DNA上标记特定的基因序列，通过镜检可以检测到目的基因所在DNA片段的损伤情况。如在彗星头部检测到FISH标记的荧光信号，则表明目的基因所在DNA片段未受损伤；反之，如在彗星尾部发现荧光信号，则表明目的基因所在的DNA片段受到损伤并发生迁移。荧光原位杂交(FISH)通常是利用cDNA或寡聚核苷酸探针在DNA变性和复性的过程中识别目的基因的序列而杂交成功的，而如何能和包埋在37℃溶解的低熔点琼脂糖中的受试DNA杂交，这是这一技术的关键所在，Santos等人没有采用高温使DNA变性，而是利用化学变性法。在加入探针前，先将玻片在变性液(0.5 M NaOH)中变性30min，然后在中和液(0.5 M Tris-HCl,pH值7.4的1 M NaCl)内中和30 min,利用梯度乙醇溶液脱水后加入探针杂交。目前用这种方法可以识别特殊染色体的DNA、端粒DNA，着丝点DNA和单拷贝基因。Reiter等人[32]利用comet-FISH技术检测了EGFR基因在病人口咽癌细胞的表达，从而证实了EGFR基因在口咽癌细胞中会过量表达。而Mosesso等人[33]利用这个技术研究了人的淋巴细胞经过X射线电离辐射后，细胞体内18号和19号染色体受到损伤和修复的差异性。尽管comet-FISH技术最近几年发展迅速，但是到目前为止还没有制定出关于这个技术的测定标准，这在一定程度上也限定了它的推广。

4 展望

从上述内容可以看出,彗星电泳的不同应用方法可以检测到多种的DNA损伤，它在检测单个细胞的DNA损伤上的优势，是其它方法不可比拟的。目前这种方法已经应用于体外和体内实验研究中，很有潜力扩展到各种细胞和组织的检测[34]。2000年英国研究基因突变的权威机构COM(UK Committee on Mutagenicity) 和2008年国际协调会议ICH(International Conference on Harmonisation)分别推荐彗星电泳作为体内检测手段而取代UDS实验( Unscheduled DNA Synthesis )，但是到目前为止还没有得到任何机构(OECD、ECVAM/ICVAM、WHO等)的认可。另外由于没有官方的实验指南作为指导，各个实验室在利用彗星电泳技术时，所应用的条件和分析手段也不尽相同，这也导致了实验结果的可比性、重复性较差。尽管如此,单细胞凝胶电泳技术的诸多优点仍然受到广大科研者的青睐。相信随着研究的深入，彗星电泳会有更加广阔的应用前景。

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