四维超声对小鼠大脑皮质神经细胞PCNA蛋白表达及超微结构的影响

李 超

（大连医科大学，辽宁 大连 116023）

作为产前例行检查的一个重要环节，超声波检查是有必要的.最近，能让未出世的宝宝与父母提前见面的“胎儿写真”服务，在北京、上海等大城市火了起来.所谓的“胎儿写真”其实就是用四维超声技术照出来的，不仅可以获得照片，还能将影像制作成光盘.胎儿写真与医院B超检查毕竟有所不同，为保证胎儿处于最佳姿态，如手不会挡住脸部等，四维彩超的操作时间往往较长，一般要持续30分钟以上，这样会对辐照部位产生更大的危害，为了提高照片清晰度，往往会采取提高声强的手段，清晰度提高了，造成胎儿畸形的可能性也相应增加了.美国医用超声波学会则警告说，虽然目前没有超声波引起缺陷的事例，但这种无人监管的胎儿摄影持续下去，超声波的强度和扫描次数增多，数年后可能造成不堪设想的后果.对这种新型超声扫描方式国内外学者对其在多大功率、多长时间上可造成机体的生物学损害尚未进行研究，对胚胎胎儿安全与否至今仍无定论[1].因此,四维超声检查技术作用于胚胎后所产生的生物学效应及其危害做相应的研究成为一项紧迫的任务.

本实验利用抗原抗体特异性结合的原理，通过四维超声对小鼠大脑皮质神经细胞PCNA蛋白表达及超微结构的影响，探讨四维超声波检查作为产前例行检查的必要性.为四维超声在临床上的安全应用提供新的理论依据.

1 资料与方法

1.1 动物模型分组及标本采集

应用成年雄性小鼠6只，成年雌性小鼠12只进行交配，在怀孕的第16天时将孕鼠仰卧固定于木板上，然后涂抹耦合剂,用3维/4维探头在孕鼠下腹部按既定时间进行滑行扫查,（见左下镜头1）对照组进行假辐照或不辐照，按照射时间不同随机等分钟为五组，I组（对照组）、II组（照射5分钟组）、III组（照射10分钟组）、IV组（照射20分钟组）、V组（照射30分钟组）每组3只.

1.2 仪器与方法

1.2.1 彩色超声诊断仪（仪器采用GE公司730型）,使用三维/四维探头,在中晚孕检查预制条件下先用二维超声引导选好扫查面，然后启动四维体表模式进行扫查，经超声功率计（美国UPLM-DT-1E）测定，彩超仪器的三维容积探头在二维模式上平均I-SPTA（空间峰值时间平均强度）约为5.5mW/cm2，在三维模式上平均I-SPTA约为7.0mW/cm2，四维模式上平均I-SPTA约为6.0mW/cm2,检查时均使用容积探头.显示器上的软组织热指数为0.2,机械指数为1.0.均符合我国国家标准（输出声束声强小于20mW/cm2）.

四维超声辐照后继续喂养至出生10天,每窝随机取两只小鼠每组共六只.四只用于光镜，两只用于电镜.2.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（0.3m l/100mg），开胸，经左心室插管，灌注生理盐水，待冲静血液后，灌注4%多聚甲醛溶液进行全身固定.最后完整取出小鼠大脑放入4%多聚甲醛溶液内固定24h以上，24小时后将固定好的组织块经常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋.冠状切面连续切片，厚度为5μm.常规苏木素-伊红（HE）染色采用过氧化酶标记的链酶卵白素进行免疫组织化学染色：切片常规脱蜡至水，0.01M PBS 清洗3次，每次5分钟，0.3%甲醇-过氧化氢室温下孵育20分钟去除内源性过氧化物酶，蒸馏水清洗3次每次5分钟，0.1M枸橼酸缓冲液（pH6.0）微波炉内修复，98℃维持20分钟，冷却至室温.10%山羊血清37℃温箱湿盒内孵育10分钟，滤纸吸去多余血清，加入一抗（鼠抗PCNA 1∶100稀释），0.01M PBS清洗3次，每次5分钟，滴加生物素化二抗（山羊抗鼠）工作液，37℃温箱湿盒内孵育30分钟，0.01M PBS清洗3次，每次5分钟，滴加辣根过氧化物酶标记链酶卵白素工作液，37℃温箱湿盒内孵育30分钟，0.01M PBS清洗3次，每次5分钟，DAB显色2-5分钟，自来水充分钟冲洗，终止显色，苏木素复染，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固.阴性对照用PBS替代一抗，其余步骤同上.

1.2.2 透射电镜下:每组欲留电镜标本的2只实验动物用Karnovsky's固定液灌流，（方法同光镜标本之灌流方法）然后将所取电镜大脑皮层标本切成约1mm的小块，浸入Karnovsky's液中固定.包埋前经0.1M PBS充分钟冲洗，1%四氧化锇后固定2h，0.1M PBS充分钟冲洗，梯度酒精逐级脱水每次20分钟，100%酒精∶丙酮（1:1）n浸透30分钟，纯丙酮浸透30分钟，丙酮∶树脂（1∶1）混合液温箱过夜，纯树脂（815、812混合液）浸透 8h，树脂包埋，37℃1天，60℃两天使之聚合，Leica超薄切片机切片厚度50nm，切片用醋酸铀和柠檬酸铅双重染色.日立H-7500型透射电子显微镜观察，加速电压100KV，10000倍照相.

1.2.3 组织学观察及统计分析：光学显微镜下观察组织学变化，400倍同样放大倍数下进行图象分析并拍照.计量资料数据以均值±标准差表示，采用SAS 8.0统计软件进行统计学分析，组间比较采用方差分析，P<0.05有统计学意义.

2 结果

2.1 组织病理学检查

正常对照组如图1所示：小鼠大脑皮质神经细胞排列整齐，胞浆内有嗜碱性颗粒；细胞核圆形着色浅、核仁清晰.照射组：照射5分钟、10分钟、20分钟组小鼠大脑皮质神经细胞形态学观察与正常对照组无明显区别.照射30分钟组形态学观察发生变化，如图2所示：神经细胞排列紊乱；部分钟细胞肿胀变大，胞核形状不规则偏于一侧、胞浆着色不均匀呈空泡状、尼氏体减少；并有部分钟神经细胞收缩坏死、呈嗜酸性、核不清楚.在光学显微镜下证明该小鼠的神经细胞在照射30分钟后从形态上开始发生变化.

图1 正常组HE染色（200×）

图2 照射30分钟组HE染色（200×）

2.2 PCNA在大脑皮层的表达结果

PCNA阳性颗粒呈棕黄色位于细胞核内，正常对照组如图3所示，棕黄色细胞核个数多.随照射时间的延长棕黄色细胞核个数逐渐减少，照射30分钟组如图4所示，棕黄色细胞核个数明显减少.

图3 正常组PCNA免疫组化染色（400×）

图4 照射30分钟组PCNA免疫组化染色（400×）

2.3 PCNA在大脑皮层的定量表达

计算单位面积内PCNA阳性细胞数并求其均值：结果显示照射10分钟、20分钟、30分钟组与对照组相比PCNA阳性细胞数表达明显减少，显示两组间有显著性差异（P<0.01）.各组之间比较见表1.

表1 照射时间对小鼠大脑皮层核增殖抗原的影响（x±s）

照射时间对小鼠大脑皮层神经细胞核增殖抗原的影响

2.4 透射电镜染色结果

正常对照组如图5所示：神经细胞细胞核呈规则圆形，核仁清楚，常染色质分布均匀.照射组：照射10分钟、20分钟、30分钟组小鼠大脑皮质神经细胞形态学都有变化，并且随着照射时间延长愈发严重.如图6所示主要表现为：①细胞核染色质分布不均，成团块状浓缩或边聚；②核周腔增大、变宽；③核周质(胞质)内糖原与游离核糖体稀疏；④大部分线粒体肿胀呈空泡化.电镜下进一步证实四维超声照射对小鼠中枢神经细胞损害，神经细胞开始出现凋亡，并随时间的进展而加重.结论：超声扫描检查5分钟后，胎儿大脑皮质神经细胞超微结构开始有变性改变，30分钟组胎儿大脑皮质细胞变性改变更为明显.

图5 正常组电镜下染色（10000×）

图6 照射30分钟组电镜下染色（10000×）

3 讨论

四维超声的发射原理和传统的2D超声相同，四维超声是边扫描边显示，是一种时实立体显像技术，只要扫描不中断便会连续向机体发射超声.超声波在生物体内传播时，通过组织间的相互作用，导致生物体机能和结构变化，称为超声波的生物效应，产生生物效应的机制是热效应和空化效应.所谓的热效应是指超声波传播过程中，部分能量被生物组织吸收转变为热能，使组织温度增高；空化效应是指超声波传播过程中与组织中的气核或微气泡相互作用，使其突然爆破，产生巨大的瞬间压力，使组织内部结构改变.一般认为由于在胎儿体内不存在空气—水界面，空化效应不会出现，而热效应在动物实验中显示是致畸形因素[2].陈光阳等通过观察诊断级超声波对活鼠胚胎心肌细胞Bcl-2及Bax表达及其凋亡的影响.认为较高强度在该过程中诊断级超声波长时间辐射可导致胎鼠心肌细胞凋亡[3].

细胞凋亡也称程序性细胞死亡，是指生理和病理情况下，细胞由各种因素调控所引起的一组形态和生化特征明确的细胞主动死亡形式.其特征为：细胞皱缩，核固缩，染色质浓集，细胞膜内陷，将细胞自行分割成被细胞膜包裹的凋亡小体，最后被周围的巨噬细胞吞噬.整个过程中，细胞内容物不外泄，故不引起炎症反应.凋亡明显区别于被动性死亡、坏死[4,5].

增殖细胞核抗原 (proliferating cell nuclear antigen，PCNA)是一个36KD酸性核蛋白，PCNA的表达越高说明DNA复制活跃程度增加，它是反映细胞增生的一项重要指标，PCNA表达水平是细胞增殖状态的标志.

本试验结果组织病理学显示超声扫描检查5分钟后，胎儿大脑皮质神经细胞超微结构开始有变性改变，在光学显微镜下证明该小鼠的神经细胞在照射30分钟后胎儿大脑皮质细胞变性改变更为明显.PCNA在大脑皮层的表达，随照射时间的延长棕黄色细胞核个数逐渐减少，照射30分钟，棕黄色细胞核个数明显减少.PCNA在大脑皮层的定量表达显示照射10分钟、20分钟、30分钟组与对照组相比PCNA阳性细胞数表达明显减少，表明四维超声照射后中枢神经细胞PCNA表达减少.透射电镜染色电镜下进一步证实四维超声照射对小鼠中枢神经细胞损害，神经细胞开始出现肿胀和凋亡现象，并随时间的进展而加重.30分钟组胎儿大脑皮质细胞变性改变更为明显.综上说明四维超声照射对胎鼠中枢神经细胞构成一定的刺激.它可抑制神经细胞的增殖并促进其凋亡，进一步推断可能引起中枢学习记忆功能障碍.因此四维超声波检查作为产前例行检查，在扫描功率及时间上应密切注意，以尽量减少对胎儿的损伤.

〔1〕Znsman I,Reifen R,Livni O.Role of apoptosis,proliferating cell nuclear antigen and p53 protein in chem ically induced colon cancer in rats fed corncob fiber treated w ith the fungus pleurotus ostreatus.Anticancer Res.1997,17(3c):2105-2113（PCNA）.

〔2〕夏国园，苏巧荣.诊断级超声对活鼠胚胎生物学效应的研究进展[J].实用放射学杂志，2004，20(6):554-555.

〔3〕陈光阳.超声波对活鼠胚胎心肌细胞凋亡影响的研究[J].中国辐射卫生，2007,16（3）.

〔4〕赵品，段云友.晚孕期彩超重复照射对胎鼠中枢神经P53蛋白表达及超微结构的影响 [J].中国医学影像技术，2005，21（8):1169-1170.

〔5〕程颜苓，段云友,田蓉.超声辐照后胎鼠脑Fos蛋白的表达与细胞凋亡的关系[J].中华超声影像学杂志，2003，12（4）.