蓖麻毒蛋白的提取及应用研究

熊冬梅，苏小军，熊兴耀，2

（1．湖南农业大学 湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室，湖南 长沙410128；2．中国农科院蔬菜花卉研究所，北京100081）

蓖麻毒蛋白来源于大戟科植物蓖麻，在蓖麻籽中的含量为1%～5%［1］。蓖麻毒蛋白由两条肽链组成，属于二型核糖体失活蛋白，具有天然植物毒素典型的半毒素结构及强烈的细胞毒性，从而造就了蓖麻毒蛋白的双面性，一方面赋予它在医学抗癌、生物农药、细胞内转运机理研究等方面的潜在作用和优势；另一方面因难以察觉且快速致命的强烈毒性使其成为恐怖袭击者的武器，威胁人类生命安全。随着蓖麻毒蛋白在医学、农业、军事防控等领域应用的拓展，研究者们对高纯度、高活性的蓖麻毒蛋白的需求进一步增多，因此获得高效提取蓖麻毒蛋白的方法具有重要意义。

1 蓖麻毒蛋白的性质、结构及作用机理

蓖麻毒蛋白为无味白色粉末或结晶型固体，不溶于有机溶剂，易溶于稀酸或盐类水溶液，能在饱和硫酸铵溶液中沉淀析出，对热、酸、碱比较稳定，干热处理不易变性［2］。

蓖麻毒蛋白是由效应链RTA和结合链RTB经二硫键结合而成的异源二聚体植物蛋白毒素，RTA由263个氨基酸残基组成，分子量32 000；RTB由259个氨基酸残基组成，分子量34 000。

蓖麻毒蛋白的作用机理是由RTB利用乳糖结合位点与细胞表面糖脂或糖蛋白受体结合，通过细胞吞噬作用将RTA携带进入细胞内，毒蛋白分子被转运至高尔基体后逆向转运到粗面内质网（ER），在ER内被蛋白质二硫键异构酶解离，游离出有催化活性的RTA，RTA 再 通 过 ERAD（ER－Associated protein degradation）途径进入胞浆催化核糖体28SrRNA脱去腺嘌呤，从而抑制细胞蛋白质的合成，最终导致细胞死亡［3］。

2 蓖麻毒蛋白的提取方法

不同提取方法获取的蓖麻毒蛋白在纯度、质量、结构等方面不同，因此提取方法直接影响着蓖麻毒蛋白的研究方向和用途。

2．1 物理化学法

物理化学法提取蓖麻毒蛋白的主要步骤是物理研磨、盐析、透析获取粗蛋白，然后利用亲和层析法进行蛋白的分离纯化。代表性的物理化学提取法是Nicolson和Blaustein的方法［4］，即磷酸缓冲溶液法粗提和琼脂糖凝胶亲和层析法分离纯化蓖麻毒蛋白。

2．1．1 蓖麻粗毒蛋白的制备

目前蓖麻粗毒蛋白的制备主要有磷酸缓冲溶液提取法和稀酸提取法。一般的步骤为：取一定量脱壳蓖麻籽匀浆后用磷酸缓冲溶液或稀酸于4℃浸泡16h；四层纱布过滤，取上清液离心20min，弃沉淀及上层脂肪；获得的液体用60%饱和硫酸铵溶液于4℃浸泡过夜，离心20min；取沉淀用磷酸缓冲溶液或稀酸进行透析，透析完成后用PEG6000覆盖脱水或真空冷冻干燥透析液，最终获得蓖麻粗毒蛋白。蓖麻粗毒蛋白的杂质越少，越利于后期的分离纯化。

为提高粗毒蛋白提取率，研究者对蓖麻粗毒蛋白制备方法做了改进。陈祥胜等［5］认为蓖麻籽匀浆中的脂肪对蛋白有较强阻隔作用，易导致蛋白不能充分提取，因此在提取前将蓖麻籽的匀浆进行脱脂，有效地提高了蛋白质的提取率，并发现磷酸缓冲溶液处理的粗毒蛋白产率明显高于稀酸提取法。王莹等［6］对蓖麻毒蛋白提取过程进行了优化，用匀浆冰浴研磨及高速冷冻离心替代常温研磨及四层纱布过滤、用4℃下聚乙二醇包埋2～3h替代透析过夜，有效地缩短了提取时间并取得较好的效果。

2．1．2 蓖麻毒蛋白的分离纯化

蓖麻粗毒蛋白中包含蓖麻毒蛋白、蓖麻凝集素、脂肪及其它一些未能除尽的蛋白和杂质，其中蓖麻毒蛋白和蓖麻凝集素具有相似性。蓖麻毒蛋白的常用分离纯化方法是亲和层析法。在获得蓖麻粗毒蛋白后，先采用Sepharose 4B柱将粗毒蛋白中蓖麻毒蛋白及蓖麻凝集素吸附在柱上，再利用RTB对半乳糖的特殊亲和能力，用含0～0．2mol·L－1D－半乳糖的缓冲溶液进行洗脱，然后用Sephadex G－100／200凝胶过滤层析，缓冲溶液洗脱，收集纯化的蓖麻毒蛋白。用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法检测蓖麻毒蛋白纯度。

随着研究工作中对蓖麻毒蛋白纯度及活性效价要求的提高，分离纯化方法也在不断地被改进。Simmons等［7］将半乳糖与Sepharose 4B共价偶联，通过梯度洗脱一步分离蓖麻毒蛋白。张振范等［8］提出直接利用0．2mol·L－1D－半乳糖洗脱Sepharose 4B柱上的蓖麻毒蛋白可将分离纯化过程直接简化为一步，无需另行合成亲和胶，从而节省了时间，也促进了蓖麻毒蛋白的大规模纯化。余涛等［9］将p－苯胺基－1－巯基－β－D－吡喃半乳糖苷琼脂糖凝胶作为亲和层析介质并结合Sephcaryl S－200凝胶介质，通过两步层析纯化大大提高了蓖麻毒蛋白的纯度。

2．1．3 RTA、RTB的分离纯化

基于更深入研究的需要，须将RTA、RTB进行分离。由于RTA与RTB的分子量相近，凝胶层析法难以将两者分离，因此，利用RTB具有半乳糖结合位点的特点，将纯化的蓖麻毒蛋白样品加样于Sepharose 4B柱，加入1BV的5%巯基乙醇封柱12h，用含5%巯基乙醇的Tris－HCl缓冲溶液洗脱得到含有少量RTB的RTA 粗品，用含0．2mol·L－1D－半乳糖的Tris－HCl缓冲溶液洗脱得到RTB粗品。将粗品上样DEAE 52柱一步纯化，由于RTA的等电点为7．6、RTB的等电点为5．5，用pH值为8．5的含5%巯基乙醇的0．1mol·L－1的 Tris－HCl缓冲溶液洗脱得到RTA纯品，用pH 值为8．5的含0．15mol·L－1NaCl及5%巯基乙醇的0．1mol·L－1的 Tris－HCl缓冲溶液洗脱得到 RTB纯品［10，11］。

2．2 生物制备法

生物制备法主要是通过基因载体向适合的受体细胞导入目的基因，构建具有高效表达目的产物能力的基因工程菌或植物，即基因工程技术表达法。受体细胞可以是微生物细胞或植物细胞。目的基因可以是RTA或RTB基因，也可以是RTA与其它功能性蛋白基因的整合或RTB与其它功能性蛋白基因的整合。因此，表达的产物可以是修饰或未修饰过的RTA或RTB蛋白、RTA融合蛋白、RTB融合蛋白。

目前生物制备法获取和研究蓖麻毒蛋白已成为热点。裴武红等［12］根据蛋白质结构同源模建及表观静电势分析，设计并扩增RTA突变体基因，通过pKK223－3载体导入大肠杆菌中，获得RTA的高效、可溶性表达，并检测到预期的生物学活性。王洪斌等［13］通过基因工程菌表达分别获得去除高度糖基化的RTA和RTB，并利用RTB介导RTA进入细胞，对细胞发挥毒性作用。Carter等［14］为增强对Ⅰ型糖尿病自身免疫疾病的抑制，利用基因工程手段将非特异性细胞表面受体蓖麻毒素（RTB）基因与编码区域的前胰岛素基因（INS）整合导入马铃薯基因，最终获得的转基因马铃薯能表达融合蛋白（INS－RTB），在动物口服试验中表现出抑制疾病的作用。Choi等［15］通过将轮状病毒SA11外衣壳糖蛋白（VP7）的编码基因与RTB基因整合并转入马铃薯基因组进行表达，获得了具有增强免疫力作用的VP7－RTB融合蛋白。

3 蓖麻毒蛋白的应用研究

近年来，蓖麻毒蛋白在生物农药、医学抗癌、细胞内运转机理研究、生物防恐等领域的应用得到广泛的研究。

蓖麻毒蛋白作为毒性最强的植物源毒素之一，同时具备了植物毒素在环境中自然降解、无残留的优点，适用于生物农药的研发，目前国内这方面的研究较多，多面向于虫鼠灾害。金汝城等［16］发现直接分离纯化的植物源蓖麻毒蛋白有较好的南方根结线虫杀灭效果。孙媚华等［17］在改进脱脂方法提取的蓖麻粗毒蛋白中添加粘米粉、糯米粉和葡萄糖等饵料，提高了鼠药的适口性，减少了小鼠的拒食行为，增强了灭鼠效果。

蓖麻毒蛋白在医学方面的研究大多集中于功能性融合蛋白的研制，包括免疫毒素、免疫融合蛋白［14］、抗原性融合蛋白［15］等，目前国外新出现的口服型植物源免疫融合蛋白的研制即是针对免疫疾病来进行的。基于RTA、RTB的不同功能特征，RTA主要用于发挥毒素效应，因此常与具备特异性结合能力的蛋白整合，用于抗肿瘤单克隆抗体的制备［18］。RTB对受体细胞具有非特异性结合性能，常与一些功能性蛋白进行整合获得相应功能的单克隆抗体，如将RTB与作用于横纹肌的烟酸型乙酰胆碱受体蛋白整合获得RTB－mAb35单克隆抗体，有助于治疗斜视［19］、制备增强机体免疫能力的抗原性融合蛋白［20］等。

由于RTB非特异结合细胞的能力，常用于细胞内转运机理方面的研究，既可单独研究蓖麻毒蛋白在细胞内的作用机理［21］，也可通过RTB将功能性融合蛋白转运至细胞内以便研究功能蛋白在细胞内的作用机理［22］。

蓖麻毒蛋白用于生物防恐的研究主要是两个方面，一方面是蓖麻毒蛋白检测方法的研究，另一方面是蓖麻毒蛋白中毒的治疗及疫苗制备。目前已建立了多种快速、灵敏、特异的蓖麻毒蛋白检测方法，如依据毒素的蛋白免疫原性而建立的免疫学分析法和生物传感器法；依据毒素的组成等建立的仪器－化学分析法［23］，而多种方法的同步检测更能提高检测的精确度。蓖麻毒蛋白在预防治疗方面主要涉及拮抗剂的制备和疫苗的研制。目前蓖麻毒蛋白拮抗剂的研究主要集中在中和性抗体、抗RTA适配体、小分子拮抗肽等方面，疫苗的研究集中在抗独特型疫苗、重组疫苗、超级疫苗、微球疫苗等方面［24］。

4 结语

虽然传统的物理化学提取法和新兴的生物制备法均能获取蓖麻毒蛋白，但相比之下，生物制备法能为蓖麻毒蛋白的应用和发展提供更多的可能性。生物制备法获取蓖麻毒蛋白的优势：（1）一旦获得具有高效表达能力的基因工程菌，可省略繁杂的粗毒蛋白提取步骤；（2）直接通过生物表达可分别自由获取蓖麻毒蛋白A链或B链，有效地防止研究中A、B链的相互干扰，避免植物源蓖麻毒蛋白A、B链协作造成的毒害作用，也可免除高度糖基化的RTB对RTA毒性作用的发挥［25］；（3）灵活多变的设计和改造目的基因，表达后获得具有特殊功能的目的产物，如删除RTA部分无用的核苷酸序列基因，使目的产物分子质量降低便于进入肿瘤细胞，将非特异性运输链RTA基因或毒性链RTB基因与相应功能蛋白基因片段整合，最终表达获得各种功能性融合蛋白。

蓖麻毒蛋白的提取方法对其应用有直接的影响，如蓖麻粗毒蛋白虽含有杂质但已具备较强的毒性，可直接用于生物农药的研制［16，26］；细胞内转运机理的研究主要涉及蓖麻毒蛋白的具有跨膜作用的运输链RTB；肿瘤导向药物——蓖麻毒素单克隆抗体制备的主要研究对象是蓖麻毒蛋白毒性链RTA等［18］。随着蓖麻毒蛋白提取方法的不断改进和更新，蓖麻毒蛋白在各个领域的应用研究及发展也获得了更多的便利性和可能性。

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