SNPs在水产动物中的研究进展

张晓萌 马普 王洪迪 王秀利

（大连海洋大学水产与生命学院，大连 116023）

作为第三代分子标记的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是基因型和表型之间最好的研究载体，已成为最为理想的遗传标记之一。随着DNA测序技术的发展，SNP分子标记发展迅速，已广泛应用于农学、医学、生物进化等众多领域［1]。SNP分子标记的出现极大地促进了遗传学、基因组学和育种学等相关学科的发展［2]。近年来，水产动物中的SNPs研究与应用取得了阶段性成果，但与人类及高等哺乳类动物差距仍较大，与畜牧业中的同类研究水平也有较大的差距。本文重点介绍SNPs在水产动物疾病、生长性状和繁殖性能等方面的研究进展。

1 SNP简介

1.1 SNP的概念

SNP是指由于单个核苷酸发生变异而引起的基因组水平上DNA序列的多态性，其形式包括单个碱基的转换、颠换、插入和缺失［3]。根据对生物遗传性状的影响，SNP可以分为蛋白编码的SNP和非蛋白编码的SNP。在蛋白编码的SNP中，如果编码序列的改变不影响所翻译的氨基酸序列则称为同义蛋白编码SNP。反之，若编码序列的改变导致翻译的氨基酸序列改变从而改变蛋白质的生物学功能或形成终止密码子使翻译终止，则称为非同义蛋白编码SNP［4]。一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，而多个核苷酸的变化则表示为SNPs。

1.2 SNP的特点

SNP具有位点丰富且分布广泛，富有代表性等优点。与串联重复微卫星（SSR）等多态性相比，SNP是基于单核苷酸的突变，其遗传稳定性与精确性相对较高［5]。另外，SNP在检测时无需像检测限制性片段长度多态性和SSR标记那样测量片段的长度，而是直接检测序列变化，从而摆脱了凝胶电泳瓶颈的限制，加上近年来各种新兴的技术层出不穷，在提高自动化检测水平的同时也提高了检出率，因而其发展速度较快［1]。

1.3 SNP的筛选和检测方法

迄今为止已经建立了多种筛选检测SNPs的技术方法［1，6]，包括等位基因特异寡核苷酸片段分析（allele-specificoligonucleotide，ASO）、 探针技术（TaqMan）、动态等位基因特异杂交（dynamk allelespecific hybridization，DAS）、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、直接测序（sequencing）及基因芯片技术（gene chip）。另外，还有以核酸构象为基础的方法［1，6]，如温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）、毛细血管电泳（capillary electrophoresis，CE）、单链构象多态性（single strand conformational polymorphism，SSCP）和变性高效液相色谱（denaturing high performanceliquid chromatography，DHPLC）等方法，其各有自己的优缺点，使用时可根据试验需求选择更加高效和经济的检测方法。

2 SNPs在水产动物方面的研究进展

2.1 SNPs在水产动物疾病方面的研究进展

在水产动物的养殖过程中，疾病的发生会直接导致产量下降进而造成经济损失。为了从遗传本质上提高养殖动物抗病能力，筛选抗病优良个体，以SNP为代表的DNA分子标记已经成为水产动物相关研究的热点之一。Zhao等［7]利用PCR-SSCP技术对凡纳滨对虾HcSC基因进行多态性检测发现 ，3个导致氨基酸序列改变进而影响了HcSC多肽链二级结构的SNPs，推测这些SNPs会影响到凡纳滨对虾对不同病原菌的抵抗能力。Lin等［8]克隆了拟穴青蟹的Toll基因，并对其LRRs结构域进行了多态性分析发现，位于1 372位点A到G的突变频率达到50%，该突变与拟穴青蟹免疫防御机制有关，会使经弧菌感染后的青蟹死亡率降低。Jeroen等［9]对鲤鱼肿瘤坏死因子TNF基因进行克隆和功能分析，在TNF1和TNF2序列3' UTR发现数个多态性，并在TNF2编码区发现一个突变，该突变产生的鲤鱼不同基因型个体对拟锥虫的抵抗能力不同。转铁蛋白是铁代谢过程中的一个多功能蛋白，在先天免疫防御机制中发挥着重要作用，被作为生物体抗病研究的一个候选基因。García-Fernández等［10]对金头鲷转铁蛋白Tf的基因结构，组成型表达和多态性进行了分析发现，平均每253 bp就有一个SNP。进一步研究发现，这些突变与金头鲷的免疫系统反应有一定的相关性。另外，Bao等［11]研究了海湾扇贝中超氧化物歧化酶SOD基因多态性及其与鳗弧菌敏感性。在3种SOD基因中共发现59个SNPs，且大部分发生在启动子上。其中位于AiCuZnSOD启动子-1 739位T-C的突变与AiECSOD启动子-498位A-T和-267位G-A的突变与海湾扇贝抗鳗弧菌性能显著相关（P<0.05）。位于Ai-ecCuZnSOD基因-38位C-A的突变导致其信号肽第13位的苏氨酸变为赖氨酸，且进一步研究发现该位点为苏氨酸的野生型个体对抗鳗弧菌的能力相对较高（P<0.05）。Li等［12]研究发现，位于栉孔扇贝溶菌酶基因启动子区的SNPs会影响栉孔扇贝对鳗弧菌的抵抗能力。Siva等［13]对栉孔扇贝抗鳗弧菌能力与肽聚糖识别蛋白（PGRP）基因多态性之间的相关性进行了研究发现，位于PGRP基因上的SNPs也会影响到栉孔扇贝对鳗弧菌的抵抗能力。

2.2 SNPs在水产动物生长性状方面的研究进展

水产养殖动物最为重要的经济性状是生长性状，包括体长、体重和体高等。因为这些性状的优劣直接影响到经济效益的高低。寻找与生长性状相关基因的多态性，并对多态性与性状之间的关联性进行分析将会为水产动物分子育种奠定基础。Wang等［14]利用PCR-SSCP技术和DNA测序的方法对103个栉孔扇贝个体的肌肉生成抑制素基因MSTN的多态性进行了筛选，并分析了其与生长性状的关联性。结果显示，位于该基因外显子2第327位A-G的突变导致其编码的氨基酸由苏氨酸变为丙氨酸，位于外显子3第289位C-T的突变导致其编码的氨基酸由半胱氨酸变为精氨酸。进一步的单因素方差分析显示第327位为G的纯合体，个体有显著增高的体重、软组织量、内收肌量、壳长和壳高。Zhu等［15]利用同样的方法对黄鲶鱼MSTN基因进行多态性分析发现，存在于该基因中的SNPs同样影响到黄鲶鱼的体长、体宽、体高和体重。同样有研究发现，大比目鱼MSTN基因中启动子区域355位点存在T-C的突变，并且该位点为C的纯合体，雌性大比目鱼体长和体重相对较高（P<0.05）［16]。Wang等［17]对具有不同生长性状的2种文蛤群体的205个个体的FBA基因进行了多态性检测，共发现4个SNPs，这些SNPs均会影响文蛤的能量代谢水平，从而推测可能与其体重相关。同样，对文蛤磺基转移酶MmeSULT基因的多态性分析显示在该基因中存在3个SNPs位点，其中位于MmeSUl-806位的突变与生长性状显著相关（P<0.05），可以作为文蛤连锁图谱构建的基因标记［18]。张丽等［19]分析了红鳍东方鲀黑皮质素受体4（MC4R）基因编码区的多态性，并于该基因48位和264位发现G-A的转换突变，两处点突变均未引起氨基酸改变，为同义突变，最小二乘分析结果显示两个突变位点对红鳍东方鲀的体重、体长、体高均没有显著性影响，可能是试验样本数太小造成的。此外，还有大量水产动物SNPs的研究，如Gross等［20]发现了能影响大西洋鲑体重的SNP，这个SNP存在于GH基因上。还有报道称，存在于太平洋牡蛎THLGC阅读框和PCHGS阅读框中的SNPs会影响其内收肌的表达水平［21]。

2.3 SNPs在水产动物繁殖性能方面的研究进展

克隆与水产动物繁殖性能相关的基因并分析其多态性与繁殖性能之间的关联，将有助于解析水产动物生殖内分泌的遗传调控机制，为提高水产动物的繁殖能力奠定基础。FOXL2基因在卵巢发育和粒层细胞分化过程中发挥着重要的作用，具有维护卵巢功能的作用。Shi等［22]利用PCR-SSCP技术对52个雌性牙鲆的FOXL2基因做了多态性检测，共发现5个多态性位点，分别为SNP1［A540C（Asn102His）和A591G（Asn119Asp）] ，SNP2［G864A（Lys210Glu）和G875A] 及SNP3（C1169A）。进一步的研究发现，SNP1与性腺指数（GSI）显著相关（P<0.05），SNP2与血清雌二醇水平呈显著相关（P<0.05），位于3'UTR的SNP3与肝指数（HSI）显著相关（P<0.05）。该研究表明FOXL2基因可以作为牙鲆分子辅助育种的候选基因。马瑞芹［23]在牙鲆CYP17-I、CYP17-Ⅱ和CYP19A基因调控区发现的SNPs，影响到牙鲆血浆中睾酮（T）水平和性腺指数（GSI），与牙鲆的繁殖性能存在显著性相关。另外，海胆中的Runx基因能影响胚发育并与全身的细胞发育与分化有关。葛辉等［24]在马粪海胆Runx基因中发现两处突变，分别为A663T的错意突变和C728T的同义突变。该错义突变使密码子编码的氨基酸由天冬氨酸变为酪氨酸，推测可能会导致Runx基因表达产物的变化，进而会影响海胆的生理机能和繁殖性能。Wang等［25]发现虾夷马粪海胆Runt-1基因（Runx基因家族成员之一）833位G到A的同义突变会导致该位点为G的纯合体个体比该位点为A的纯合体个体有显著增高的性腺重量（P=0.029）。

2.4 SNPs在水产动物其他方面的研究进展

在制作水产动物的基因图谱方面，SNP分子标记发挥着无法取代的作用。而制作遗传图谱对于深入研究水产动物基因组的相关功能和繁育优良水产品种都是十分重要的。Castao-Sánchez等［26]利用SNP分子标记构建出了日本比目鱼的基因图谱。Moen等［27]利用SNP标记为大西洋鳕鱼建立了遗传连锁图谱。 Stickney等［28]利用SNP和寡核苷酸微阵列技术构建了斑马鱼的遗传图。Abadía-Cardoso等［29]利用已知基因组数据库中的EST序列设计引物对虹鳟鱼480个基因进行了多态性分析，为构建虹鳟鱼的遗传图谱奠定了基础。He等［30]对蓝鲶鱼和斑点叉尾鮰的EST序列进行了比较分析发现，每100 bp就有1.32个SNPs，该研究结果有利于蓝鲶鱼和斑点叉尾鮰的种间资源家系遗传图谱的构建。此外，Garvin等［31]发现存在于太平洋北部不同区域的大麻哈鱼种群中的SNPs严重影响了大麻哈鱼在海洋中分布情况。

3 结语

SNPs 已在玉米、大豆、鸡及猪等动植物育种和生产中有许多应用研究，主要集中在辅助育种、基因定位等方面［32，33]。尽管水产动物的SNPs研究起步较晚，但已取得了一些进展。今后，对水产动物SNPs位点的批量发掘及其与性状的关联性验证是水产动物分子标记育种研究的重点方向之一。

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