人溶血磷脂酸受体1基因的克隆、表达载体构建及瞬时转染293T细胞

李铁威 赵鹏飞 马洁 阿拉坦高勒

人溶血磷脂酸受体1（LPAR1）是G-蛋白偶联受体家族、EDG亚家族成员（EDG family）［1-3］，LPAR1在人体正常组织中普遍表达并可在溶血磷脂酸（Lysophosphatidic Acid，LPA）的诱导下与 Gi、Gq、G12/13偶联介导诸多的细胞生理反应，如细胞增殖、分化、血小板凝集以及在肿瘤细胞中促进细胞的能动性、迁移等生物活性［4-8］。人的LPAR1基因位于人基因的9q31.3区，CDS区长1095bp，编码364个氨基酸形成七次疏水跨膜蛋白结构，分子量大约为 41kD［7，9-11］。LPAR1能够感知细胞外LPA的刺激与Gi蛋白偶联抑制cAMP的生成［9］。随着对LPAR1介导的信号通路的深入研究发现，LPAR1可能参与细胞增殖与迁移及其相关疾病过程［3，12，13］。为进一步研究 LPAR1参与动脉硬化、肿瘤等疾病的发生、发展及迁移等问题，本研究克隆了LPAR1基因并构建表达载体，瞬时转染细胞，检测细胞内cAMP的积累，旨在为进一步研究溶血磷脂酸受体LPAR1的功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验细胞及主要试剂 人胃癌细胞BGC803（本研究室保存）。限制性内切酶 BamHⅠ、XhoⅠ、DNase及T4DNA连接酶（Thermo Scientific公司）；TranStart Taq DNA polymerase（北京全式金公司）；总RNA提取试剂盒、胶回收试剂盒（上海生工生物有限公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；DMEM高糖（Gibco公司）；胰酶（Hyclone公司）；脂质体LipofectamineTM2000（Invitrigen公司）；DNA分子量标准（北京中科瑞泰公司）、反转录试剂盒（TaKaRa）、实时定量试剂盒（北京康为世纪），pCR2.1载体（Invitrogen公司）；pIRES2-EGFP（Clontech）；293T细胞（本研究室保存），LPA（Sigma），ISP（Isoproterenol，异丙肾上腺素，Sigma），ELISA 试剂盒（AAT Bioquest），其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 主要仪器 PCR 仪为ABI公司产品，凝胶电泳仪和荧光定量PCR仪为Bio-Rad公司产品，荧光倒置显微镜为尼康公司产品。

1.2 方法

1.2.1 LPAR1基因的克隆 从人胃癌细胞BGC-803提取总RNA，以反转录得到的产物为模板，基因库查找编码人LPAR1的mRNA序列，用primer 5软件设计引物，序列如下：上游引物P1：5'-CTCGAGATGGCTGCCATCTCTACTTC-3'，下游引物P2：5'-GGATCCCTAAACCACAGAGTGGTCATTG-3'（上海生工生物有限公司合成），其中下划线为XhoⅠ和BamHⅠ酶切位点；扩增长度1107bp。PCR 反应体系 ：上游引物（10μmol/L）1.5μL，下游引物（10μmol/L）1.5μL，双蒸水 31.5μL，10×GC Enhance 5μL，dNTPs（各 2.5mmol/L）4μL，10×TranStart Taq Buffer 5μL，TranStart Taq DNA polymerase 0.5μL，模板 1μL。反应条件 ：94℃预变性5min；94℃变性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸 60s，30个循环；最后再于72℃延伸10min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，纯化回收 PCR产物，回收产物与pCR2.1载体连接，连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，蓝白斑筛选阳性（pCR2.1-LPAR1）克隆，送测序。

1.2.2 构建表达载体 用XhoⅠ、BamHⅠ双酶切pCR2.1-LPAR1与pIRES2-EGFP载体，酶切产物回收后用T4 DNA连接酶在16℃连接过夜，连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆PCR鉴定，送测序。

1.2.3 瞬时转染293T细胞 293T细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM培养基中，胰酶消化制成单细胞悬液，以 2×105个/孔接种于6孔板。提取并纯化pIRES2-EGFP-LPAR1和pIRES2-EGFP质粒，用NanoDrop 核酸蛋白测定仪nd1000测定质粒浓度和纯度，分别转染293T细胞。24h后观察荧光照相，36h提取细胞总RNA。

1.2.4 实时定量PCR检测目的基因的表达 收集未转染及转染上述2种质粒的293T细胞，用总RNA提取试剂盒提取各组细胞的总RNA，再用DNA酶Ⅰ去除RNA中可能残余的基因组DNA，NanoDrop核酸蛋白测定仪nd1000检测浓度。用反转录试剂盒反转录成cDNA。GoldStar TaqMan Mixture 康为世纪试剂盒用来实时定量PCR检测目的基因在各组细胞中的表达。所用引物如下：LPAR1基因检测引物，上游引物：5'-CGTCAGGGCCTCATTGACA-3'，下游引物：5'-GTGCCTCTCGATTGCAATAGC-3'，LPAR1基因探针序列：5'-CCTGACGGCATCTGTGGCCAACTTA-3'；以GAPDH基因为内参，上游引物：5'-CCAGGTGGTCTCCTCTGACTTC-3'，下游引物5'-GTGGTCGTTGAGGGCAATG-3'，GAPDH基因 探 针 序 列：5'-ACAGCGACACCCACTCCTCCACCTT-3'；反应体系：2×GoldStar TaqMan Mixture 25μL， 上 下 游 引 物（10μmol/L）各 1μL，探针（Probe）1μL，DNA 模板 2μL，RNase-Free Water 20μL，共 50μL。反应条件 ：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃（LPAR1）和60℃（GAPDH）退火1min，循环39次；每个反应有3次重复。

1.2.5 ELISA检测LPA刺激下的cAMP含量 用ELISA试剂盒所给cAMP标准品制作标准曲线，LPA和ISP刺激转染空载体（pIRES2-EGFP）和插入LPAR1基因载体（pIRES2-EGFP-LPAR1）的细胞4min然后用1mol/L HCl终止反应；裂解细胞收集胞内cAMP。用ELISA试剂盒在荧光激发波长540nm和发射波长590nm处检测LPA和ISP刺激下胞内cAMP的积累量。

1.2.6 统计学分析 采用GraphPad Prism 5统计学软件one-way ANOVA进行数据处理分析。

2 结果

2.1 LPAR1编码区片段的克隆与序列测定

用引物P1、P2以 cDNA为模板扩增得到与预期片段大小相符的特异性片段（图1）。回收的PCR产物与pCR2.1载体连接成的重组质粒pCR2.1-LPAR1经酶切鉴定正确（图2）。序列测定结果表明，扩增出的cDNA片段长1107bp，与已知的NCBI 基因库中人LPAR1（NM_001401）序列完全一致。

图1 LPAR1的PCR琼脂糖电泳结果

图2 pCR2.1-LPAR1酶切鉴定电泳结果

2.2 表达载体pIRES2-EGFP-LPAR1的构建

获得的重组质粒pCR2.1-LPAR1和表达载体质粒 pIRES2-EGFP 经 XhoⅠ+BamHⅠ双酶切（图 3），再将LPAR1（1107bp）片段与pIRES2-EGFP酶切产物连接，得到的表达载体pIRES2-EGFP-LPAR1，经XhoⅠ+BamHⅠ双酶切pIRES2-EGFP及pIRES2-EGFP-LPAR1鉴定与预期序列大小相符。

图3 pIRES2-EGFP-LPAR1酶切鉴定电泳结果

2.3 转LPAR1基因293T细胞检测

pIRES2-EGFP-LPAR1 转染293T细胞24h后观察荧光（图4），统计阳性细胞，转染率约为61％。

图4 转染24h后观察图（100×）

2.4 实时定量PCR检测LPAR1基因在293T细胞中的表达

LPAR1基因的表达检测，分别提取未转染细胞、转染空载体（pIRES2-EGFP）的细胞和转染插入LPAR1片段载体的细胞中总RNA并去除其中的基因组DNA，反转录成cDNA后，以实时定量PCR法检测LPAR1基因的表达，检测到LPAR1基因表达水平显著提高，与未转染的细胞比较mRNA 表达提高71倍（图5）。

图5 pIRES2-EGFP-LPAR1转染后的293T细胞中LPAR1基因相对表达量检测

2.5 ELISA检测转基因细胞的cAMP含量

cAMP的检测用10μmol/L LPA分别刺激转染空载体（pIRES2-EGFP）的细胞和转染插入LPAR1基因片段载体后的细胞并用1mol/L HCl终止反应，裂解细胞收集细胞裂解液，用ELISA试剂盒检测cAMP的含量，检测到转染LPAR1基因的细胞cAMP降低（与转染空载体的细胞比较）（图6）。ISP（Isoproterenol，异丙肾上腺素）能够刺激促进cAMP的产生，在1μmol/L ISP的存在下混以不同浓度的LPA刺激转染LPAR1基因的细胞，检测到胞内cAMP的积累量随着LPA浓度的升高而降低（图7）。

图6 LPA刺激转染pIRES2-EGFP-LPAR1后的293T细胞中cAMP表达量检测

图7 LPAR1转基因细胞中不同浓度LPA刺激后cAMP含量检测

3 讨论

LPA是在血浆、血清、组织液及脑组织等体液与组织中广泛存在的生理活性磷脂小分子［14］，在体内有着广泛的生物学作用，如，细胞增殖、细胞运动等；同时，LPA通过LPAR1与结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、动脉粥样硬化、神经性疼痛等疾病密切相关［13，15-19］。LPA 通过 LPAR1偶联 Gi蛋白的信号通路抑制 cAMP 的产生［4，7，16］。为了详细研究人溶血磷脂酸受体LPAR1的功能以及其介导的细胞内信号转导通路，本试验克隆了人的LPAR1基因以及构建真核表达载体质粒pIRES2-EGFP-LPAR1，用脂质体介导瞬时转染293T细胞，发现293T细胞具有极低量的LPAR1基础表达。转染pIRES2-EGFPLPAR1后，293T细胞的LPAR1mRNA表达提高71倍（与未转染的细胞比较）。通过检测LPA刺激转染pIRES2-EGFP-LPAR1的细胞cAMP的含量，发现转染pIRES2-EGFP-LPAR1的细胞cAMP的含量低于转染空载体（pIRES2-EGFP）的细胞，证实了该转基因细胞成功表达了活性的LPAR1蛋白，能够满足于进一步的试验需要。又通过在1μmol/L ISP（Isoproterenol）和浓度梯度的LPA共刺激LPAR1转基因细胞发现LPA可以剂量依赖性的抑制cAMP的形成，且存在着线性关系。

本研究采用瞬时转染LPAR1基因，获得约为61％的转染细胞，此时细胞基因表达相比未转染的细胞便高出71倍，说明本试验成功构建得到LPAR1基因的真核表达质粒；此外当细胞群中有61％的细胞高表达LPAR1时细胞应答所造成的差异便具有很高的显著性，而实际当所有细胞均高表达LPAR1时所造成的差异应该比此更加明显。Gerrard等［20］研究发现，在激活血小板的过程中检测到多种分子形态的LPA分子，酰基烃链的C原子数和脂肪酸的饱和度不同使LPA具有不同的分子结构。随后研究发现不同分子形态的LPA活化LPAR1受体的能力不同且在一定程度上存在着拮抗效应，其共同作用发挥其所介导的下游信号通路功能［21］，因此通过普通的方法检测活化LPAR1受体的LPA浓度存在一定的难度，需要进一步的深入研究。

4 结论

克隆LPAR1基因并构建LPAR1基因的真核表达质粒pIRES2-EGFP-LPAR1，瞬时转染293T细胞获得LPAR1转基因细胞模型，LPAR1基因得以高表达。此外LPAR1被激活后能强烈抑制由ISP诱导的cAMP积累，其作用具有LPA剂量依赖性。

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