γ-分泌酶抑制剂对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的作用

杨 阳，段维勋，王 宁，梁振兴，姜 鹏，周 建，金振晓，易定华

·基础研究·

γ-分泌酶抑制剂对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的作用

杨 阳，段维勋，王 宁，梁振兴，姜 鹏，周 建，金振晓，易定华

目的γ-分泌酶抑制剂（DAPT）是Notch信号通路特异性阻断剂，本实验将研究DAPT对SD大鼠离体心脏缺血再灌注损伤（I/RI）的影响，为探明Notch信号通路在心肌I/RI中的作用提供理论依据。方法采用离体大鼠心脏Langendorff逆行灌注模型，缺血50 min，再灌注60 min。实验分为4组，分别为正常对照组（Control）、I/RI组、DAPT（1 μM）+I/RI组，DAPT（1 μM）组。监测缺血前后血流动力学各项指标，包括：心率（HR）、左心室发展压（LVDP）、左心室内压最大变化速率（+dp/dtmax）、冠脉流量（CF）、计算出心率压力指数（DP，LVDP×HR/1000）；氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法测定各组心肌梗死（MI）的面积；专用试剂盒测定冠脉流出液（CF）中乳酸脱氢酶含量（LDH）。结果与Control组比较，I/R组缺血后各时间点的收缩及舒张功能均显著降低（P＜0.01），MI面积显著增加（P＜0.01），冠脉流出液中LDH含量显著升高（P＜0.01）；与I/RI组比较，DAPT+I/RI组可以加重上述指标进一步恶化（P＜0.01）；与Control组比较，DAPT各项指标无统计学差异（P＞0.05）。结论DAPT有加重心肌缺血再灌注损伤的作用，Notch信号通路可能在心肌缺血再灌注损伤中发挥重要的调控作用。

γ-分泌酶抑制剂；离体大鼠心脏；缺血再灌注损伤；心肌保护

心肌缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，I/RI）是缺血性心肌病和体外循环心脏手中过程中十分常见的病症，其病理机制复杂，有很多信号通路和细胞因子参与其中［1-4］。Notch信号通路在心血管系统的发生、发育、病理和生理过程中发挥重要作用［5］。研究提示Notch信号通路可能在心肌梗死后心肌保护中发挥调控作用［6-7］，而Notch信号通路在心肌急性I/RI中的研究尚无报道。γ-分泌酶抑制剂（DAPT）是Notch信号通路特异性阻断剂，研究显示DAPT可以有效的抑制Notch信号通路［8-9］。研究指出血流动力学降低、心肌梗死（MI）面积增加和乳酸脱氢酶（LDH）释放增多是心肌I/RI的重要的病理特征［2，10-11］。因此，血流动力学、MI面积和LDH释放量可以作为反映心肌损伤程度的重要指标。本研究将以SD大鼠离体灌注心脏作为研究对象，观察DAPT对心肌I/RI的影响，为探明Notch信号通路在心肌I/RI中的作用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象 成年Spragure-Dawley大鼠，雄性，220～250 g，由第四军医大学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂和仪器 DAPT（Santa Cruz公司，美国），2，3，5-氯三苯四唑（Sigma公司，美国），LDH检测试剂盒（南京建成公司，中国）。Langendorff离体心灌注系统（Radnoti公司，美国），MP100压力换能器（Biopac Systems公司，美国）。

1.3 离体心脏灌注模型的建立及实验分组 根据文献［12］所述，Langendorff系统采用经典的KH液灌装，KH缓冲液成分（mmol/L）：NaCl 118、KCl 4.7、CaCl21.25、MgSO41.2、KH2PO41.2、NaHCO325及葡萄糖5.5。灌流前50 min，以体积分数为95%的O2和5%的CO2混合气体向储液罐内的灌流液中持续通气，灌流液的温度维持在37℃，pH维持在7.35～7.45。SD大鼠腹腔注射戊巴比妥（30 mg/kg）和肝素（500 U/kg），大鼠麻醉后，迅速开胸取心脏，立即放入预冷的KH缓冲液（4℃）。将主动脉根部迅速固定于灌注管口，于37℃下用KH液逆行恒压灌注（灌注压为80 mm Hg）。心脏复跳后，于左心耳处剪一小口，将带有乳胶水囊的测压管经二尖瓣插入左心室。连接压力换能器，调节水囊使左心室舒张末压为5～10 mm Hg左右，心脏稳定灌注10 min，待心跳稳定后记为灌注开始，按分组进行灌注。

32只SD大鼠随机分为4组（n＝8），即空白对照（Control组）、I/RI组、DAPT（1 μM）+I/RI组，DAPT（1 μM）组。采用离体大鼠心脏Langendorff逆行灌注模型，各组均稳定灌注10 min。10 min后，Control组用KH液灌注直至120 min；I/RI组停止灌注50 min，然后用KH液再灌注直至120 min；DAPT（1 μM）+I/RI组稳定后用含有1 μM DAPT的KH液灌注10 min，然后缺血50 min，再用正常KH液灌注至120 min；DAPT组不停止灌注，稳定后用含有1 μM DAPT的KH液灌注10 min，然后换正常KH液灌注至120 min。

1.4 血流动力学监测 采用MP100换能器记录心脏缺血前及再灌注后15 min、30 min、45min及60 min时的心率（HR）、左心室发展压（LVDP）、左心室内压最大变化速率（+dp/dtmax），并计算出心率压力指数（DP，LVDP×HR/1000）。收集这些时间点的冠脉流出液，并记录冠脉流量（CF）。

1.5 心肌梗死面积的TTC染色法检测 根据文献［12］所述，心脏处理完毕后于-70℃冷冻10 min，继之沿心脏长轴切成横切面1～2 mm的切片，每个心脏取直径最长的一片。切片在TTC及0.1 mol/L磷酸盐缓冲液中孵育30 min（pH调整至7.4，温度37℃），再置于40 g/L的甲醛中固定过夜，并行数码摄影。用linage J 1.37软件行图像分析，显砖红色者为正常区域，显灰白色者为梗死区域。梗死面积由总坏死区占总切片区的百分数来表示。

1.6 冠脉流出液中LDH检测 根据文献［12］所述，留取各组第75 min时冠脉流出液，LDH检测试剂盒检测流出液中LDH含量，严格按照说明书操作。

1.7 统计学方法 以SPSS 16.0统计软件进行统计分析，实验结果以均数±标准差（±s）表示。差异显著性检验采用单因素方差分析，比较二组间差异用LSD-t检验，P＜0.05有显著性差异。

2 结 果

2.1 血流动力学指标及描记图 血流动力学监测结果显示：与I/R组比较，DAPT+I/R组复灌后各时间点的LVDP、+dp/dtmax以及DP都明显降低（P＜0.01）；与Control组相比，DAPT组在加药10 min内心率减慢，而LVDP、+dp/dtmax升高（P＜0.01），药物去除后，心脏LVDP和+dp/dtmax逐渐恢复到正常水平，各项指标与Control组无统计学差异（P＞0.05），见图1和表1。

2.2 MI面积的测定 TTC染色方法检测结果显示：与I/R组比较，DAPT+I/R组MI面积明显增加（P＜0.01）；与Control组比较，DAPT组MI面积无统计学意义（P＞0.05），见图2。

2.3 各组冠脉流出液中LDH检测结果 LHD检测结果显示：与I/R组比较，DAPT+I/R组LDH水平明显增加（P＜0.01）；与Control组比较，DAPT组LDH水平无统计学意义（P＞0.05），见图3。

表1 各组心脏血流动力学监测结果（n＝8，±s）

表1 各组心脏血流动力学监测结果（n＝8，±s）

注：R：再灌注；与Control组比较∗P＜0.01；与I/RI组比较＃P＜0.01。

组别项目（min）HR（beats/min）LVDP（mm Hg）+dP/dtmax（mm Hg/s）DPCF（ml/min）Control组10295.3±5.197.2±3.11962±7228.70±0.1012.82±0.64 75290.2±7.395.2±4.31922±9227.56±0.0812.57±0.55 90288.3±5.792.7±5.01879±10826.24±0.1212.33±0.59 105280.0±5.889.2±4.71805±11624.86±0.1411.86±0.50 120275.5±5.587.8±4.51779±9823.91±0.1711.24±0.72 IR组10296.2±5.595.5±2.11957±6428.31±0.1312.91±0.50 75（R15）279.2±6.2∗56.3±4.2∗1153±108∗15.25±0.08∗10.52±0.45∗90（R30）272.5±5.3∗48.7±4.3∗991±89∗12.21±0.06∗8.36±0.53∗105（R45）264.9±5.8∗40.9±4.9∗835±105∗10.65±0.12∗8.28±0.61∗120（R60）260.1±6.5∗36.6±4.2∗754±98∗9.51±0.11∗7.85±0.63∗DAPT+IR组10298.4±4.798.6±6.31967±6628.42±0.1412.93±0.42 75（R15）270.2±5.5∗＃42.0±5.0∗＃835±87∗＃11.43±0.15∗＃8.17±0.51∗＃90（R30）268.0±6.4∗＃40.2±5.7∗＃802±115∗＃10.84±0.10∗＃7.58±0.65∗＃105（R45）262.5±5.7∗＃33.7±6.5∗＃664±96∗＃8.72±0.12∗＃7.26±0.59∗＃120（R60）262.4±5.4∗＃27.2±6.2∗＃547±90∗＃7.15±0.13∗＃7.11±0.5∗＃DAPT组10297.9±5.896.5±3.71978±5228.32±0.0812.93±0.36 75289.6±6.890.7±6.81856±10226.33±0.1612.77±0.54 90284.5±7.593.0±7.21903±8426.82±0.1312.16±0.44 105282.5±5.687.3±6.6＃1785±92＃24.70±0.17＃12.02±0.64 120280.3±6.386.9±5.9＃1781±75＃23.89±0.13＃11.39±0.56

图1 DAPT对离体心脏LVDP影响的描记图

图2 TTC染色测定各组MI面积

图3 各组冠脉流出液中LDH水平检测

3 讨 论

缺血性心脏病（ischemic heart disease，IHD）是危害人类健康的第一杀手，我国现有患者超过2 000万人，且每年新增100万人左右，其治疗的核心就是重新恢复心肌血液供应，但缺血心肌组织重新恢复血液供应（再灌注）后常继发和加重心肌组织损伤，即心肌I/RI［1］，常导致患者死亡、预后不良、严重并发症发生，是IHD临床治疗效果不佳的主要原因之一。心肌I/RI的病理机制复杂，有很多信号通路和细胞因子参与其中［1-4］。研究提示Notch信号通路可能在心肌梗死后心肌保护中发挥调控作用［5-7］，而Notch信号通路在心肌急性I/RI中的研究尚无报道。DAPT是一种γ-分泌酶抑制剂，研究显示DAPT可以有效的抑制Notch信号通路［8-9］。LDH广泛存在于心肌细胞内，当细胞受损时，细胞内酶释放到细胞外，使血清酶升高，故LDH的检测可作为心肌损伤诊断方法［10-11］。

本研究结果显示：DAPT可以加重离体心脏I/RI，表现为心脏血流动力学减弱、心肌梗死面积增加、冠脉流出液中LDH释放量增加。由此，我们推测：Notch信号通路的完整对减弱心肌I/RI有重要作用。本研究为Notch信号通路参与调控心肌I/RI过程提供了理论依据，有利于寻找全新药物作用靶点对心肌I/RI的主要作用环节进行干预，对于获得全新的心肌保护方法提供了新的思路。

［1］Botker HE，Kharbanda R，Schmidt MR，et al.Remote ischaemic conditioning before hospital admission，as a complement to angioplasty，and effect on myocardial salvage inpatients with acute myocardial infarction：a randomised trial［J］.Lancet，2010，375（9716）：727-734.

［2］Kleinbongard P，Schulz R，Heusch G.TNFα in myocardial ischemia/reperfusion，remodeling and heart failure［J］.Heart Fail Rev，2011，16（1）：49-69.

［3］杨阳，段维勋，金振晓，等.姜黄素对血管内皮细胞过氧化氢损伤的保护作用及其机制研究［J］.中国体外循环杂志，2011，9（4）：239-242.

［4］杨阳，段维勋，周京军，等.γ-分泌酶抑制剂对正常乳鼠心肌细胞的影响［J］.中国体外循环杂志，2011，9（2）：89-92.

［5］Nemir M，Pedrazzini T.Functional role of Notch signaling in the developing and postnatal heart［J］.J Mol Cell Cardiol，2008，45（4）：495-504

［6］Oie E，Sandberg WJ，Ahmed MS，et al.Activation of Notch signaling in cardiomyocytes during post-infarction remodeling［J］.Scand Cardiovasc J，2010，44（6）：359-366.

［7］Gude NA，Emmanuel G，Wu W，et al.Activation of Notch-Mediated Protective Signaling in the Myocardium［J］.Circ Res，2008，102（9）：1025-1035.

［8］Subramaniam D，Ponnurangam S，Ramamoorthy P，et al.Curcumin Induces Cell Death in Esophageal Cancer Cells through Modulating Notch Signaling［J］.PLoS One，2012，7（2）：e30590.

［9］Mori M，Miyamoto T，Yakushiji H，et al.Effects of N-［N-（3，5-difluorophenacetyl-L：-alanyl）］-S-phenylglycine t-butyl ester（DAPT）on cell proliferation and apoptosis in Ishikawa endometrial cancer cells［J］.Hum Cell，2012，25（1）：9-15.

［10］Zhang L，Ma J，Liu H.Protective Effect of Ischemic Postconditioning against Ischemia Reperfusion-Induced Myocardium Oxidative Injury in IR Rats［J］.Molecules，2012，17（4）：3805-3817.

［11］Wang N，Min X，Li D，et al.Geranylgeranylacetone protects against myocardial ischemia and reperfusion injury by inhibiting high-mobility group box 1 protein in rats［J］.Mol Med Report，2012，5（2）：521-524.

［12］Duan W，Yang Y，Yan J，et al.The effects of curcumin posttreatment against myocardial ischemia and reperfusion by activation of the JAK2/STAT3 signaling pathway［J］.Basic Res Cardiol，2012，107（3）：1-12.

体外循环学会会议通知

第6届全国体外循环学术会议暨首届亚太体外生命支持学术会议，会议简称：APELSO 2013（The 6th National Meeting of Extra-Corporeal Circulation and The 1st Conference of Asia-Pacific Chapter of Extracorporeal Life Support Organization），将于2013年10月11日至13日在北京国际会议中心举办。此会也是ECMO国际学术会议首次在我国举办。大会将邀请ECMO开拓者、ELSO创始人Robert Bartlett教授及现任ELSO主席、AmSECT主席以及欧洲和亚太地区ECMO治疗中心的首席专家来分享他们在ECMO领域的丰富经验。会前将举办现场ECMO模拟培训。

此次盛会恰逢体外循环分会成立及《中国体外循环杂志》创刊十周年，届时将举办隆重的庆祝活动。会议详细信息请访问会议网站（http：//cn.apelso2013.chinacpb.com/或http：//apelso2013.chinacpb.com/）或中国生物医学工程学会体外循环学会网站（http：//www.chinacpb.com/）。

2013年4月举办“全国ECMO学习班”，为期2～3天，地点：暂定北京阜外医院。

Effects of γ-secretase inhibitor on isolated rat heart induced by ischemia reperfusion injury

Yang Yang，Duan Wei-xun，Wang Ning，Liang Zhen-xing，Jiang Peng，Zhou Jian，Jin Zhen-xiao，Yi Ding-hua
Department of Cardiovascular Surgery，Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Shaan＇xi Xi＇an 710032，China

ObjectiveDAPT is a specific inhibitor of Notch signaling pathway，our study investigated the effects of DAPT on isolated rat hearts induced by ischemia reperfusion injury（I/RI），and to explore the role of Notch signaling pathway in myocardial ischemia reperfusion injury（I/RI）.MethodsThe hearts of SD rats were isolated，underwent Langendroff perfusion，and were divided into 4 groups：Control，I/RI，DAPT（1 μM）+I/RI，DAPT（1 μM）.Myocardial injuries in the rat hearts were produced by ischemia for 50 min and followed by 60 min reperfusion.HR，LVDP，±dp/dt max，CF and DP were recorded respectively before ischemia and 15，30，45 and 60 min after reperfusion；the myocardial infarct size（MI）was detected by TTC test；the special kits were used to detect the levels of lactic dehydrogenase（LDH）in the coronary flow（CF）.ResultsIn the I/R group，the systolic and diastolic functions significantly reduced（P＜0.01），the MI and LDH in the CF increased significantly（P＜0.01）.Compared to the I/RI group，the above parameters in DAPT+IR group were worse（P＜0.01）；compared to the Control group，the parameters in DAPT group had no significant difference（P＞0.05）.ConclusionDAPT can aggravate the myocardial I/RI，Notch signaling pathway may play a vital regulatory role in the myocardial reperfusion injury.

DAPT；Isolated rat heart；Ischemia reperfusion injury；Myocardial protection

R654.1

A

1672-1403（2013）01-0041-04

2012-04-10）

2012-05-28）

国家自然科学基金资助（81070198，81102687）陕西省社会发展推动基金资助（2012JQ4001，2012SF2-21-1）

710032西安，第四军医大学西京医院心血管外科（杨 阳、段维勋、王 宁、梁振兴、金振晓、易定华）；223100淮安，中国人民解放军第82医院骨科（姜 鹏）；010010呼和浩特，中国人民解放军第253医院口腔科（周 建）