Survivin、NF-κB在结直肠癌中的表达及临床意义

杨志诚 赵云刚 刘明雨

结直肠癌是人类常见的恶性肿瘤，居全世界恶性肿瘤死因的第二位，近年来发病率呈明显上升趋势［1］。侵袭转移是结直肠癌的重要死亡原因，也是影响临床治疗和预后的主要因素。研究表明，多种生物因子与肿瘤的侵袭转移相关。本实验应用免疫组化SP法检测凋亡抑制因子Survivin和核因子-κB(NF-κB)在65例结直肠癌标本中的表达，探讨Survivin和 NF-κB与结直肠癌病理参数的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集我院2009年9月至2012年3月手术切除的原发性结直肠癌患者标本65例，其中，男38例，女27例;所有标本均有明确病理分型，患者术前均未接受放疗、化疗;有结直肠癌家族史者不纳入本试验。结肠癌35例，直肠癌30例;低分化癌28例，中、高分化癌37例;有淋巴结转移30例，无淋巴结转移35例;DukesA期13例，B期21例，C期28例，D期3例。并取40例患者癌旁正常组织，距肿瘤边缘10 cm以上各1块。中性甲醛固定，常规乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋并制备4 μm厚连续病理切片，切片分别进行HE染色和免疫组织化学染色。

1.2 免疫组织化学染色 兔抗人Survivin、NF-κB多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，SP试剂盒、DAB试剂盒购自中杉金桥公司。切片脱蜡至水，采用免疫组织化学链霉素-生物素过氧化酶(SP)染色法，切片置于抗原修复液(0.01 mol/L柠檬酸盐)中高压锅热修复30 min，在3%H2O2-甲醇溶液中浸泡10 min以灭活内源性过氧化氢酶，10%山羊血清封闭10 min，加入 Survivin抗体(稀释度1∶200)、NF-κB 抗体(稀释度 1∶300)，4℃过夜，免疫组织化学染色均按SP试剂盒推荐方法进行。

1.3 结果判断 细胞膜和(或)细胞质中出现棕黄色颗粒为Survivin阳性细胞，细胞质和(或)细胞核出现棕黄色颗粒为NF-κB阳性细胞。判断采用半定量积分法［2］，记数5个高倍视野，将平均阳性细胞率分为5类:0分＜5%;1分5% ～＜25%;2分25% ～＜50%;3分50% ～＜75%;4分≥75%。根据阳性染色强度分为4类:无着色0分;淡黄色1分;黄色2分;棕黄色3分;两者积分相加，按积分高低分为:0～1分为阴性(－)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为阳性(++)，6～7分为强阳性(+++)。把弱阳性、阳性、强阳性均定义为阳性。

1.4 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计数资料采用χ2检验、四格表概率法对数据进行统计，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Survivin、NF-κB在结直肠癌组织中及癌旁正常组织中的表达 Survivin蛋白阳性反应物主要位于癌旁和癌细胞胞质中，为浅黄和棕黄色，染色均匀，癌组织表达的阳性率为72.31%(47/65)。正常大肠黏膜中未见 Survivin蛋白表达，癌组织与对照非癌组织中表达差异有统计学意义(P＜0.01)。NF-κB蛋白阳性反应物位于胞浆和(或)细胞核，结直肠癌中NF-κB的阳性率为58.46%(38/65)，癌旁正常组织的阳性率为17.5%(7/40)，两者比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.2 Survivin、NF-κB在结直肠癌组织中的表达与临床病理特征的关系 Survivin、NF-κB蛋白的阳性表达均与患者的年龄、性别、肿瘤大小无相关性(P＞0.05)，与癌组织的Dukes分期、分化程度和淋巴结转移相关(P＜0.01)。

2.3 Survivin、NF-κB蛋白在结直肠癌中表达的关系 47例Survivin阳性表达病例中NF-κB阳性表达32例，18例Survivin阴性表达病例中NF-κB阳性表达6例，Survivin与NF-κB的表达差异有统计学意义(χ2=6.373，P=0.012)。随机计数5个高倍视野的Survivin与NF-κB均表达阳性的细胞数，Survivin与NF-κB 的阳性表达率呈正相关(r=0.75，P＜0.01)。

3 讨论

结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤，其发生和发展机制尚未完全明了。NF-κB存在于体内多种细胞中，NF-κB与其调节蛋白IKB-α结合后在细胞质中以非活性形式存在，通过IKB激酶(IKK)作用，IKB-α可发生32、36位的丝氨酸磷酸化而降解，并与NF-κB分离，NF-κB转位进入细胞核内与靶基因启动子结合，迅速诱导靶基因 mRNA的合成，参与多种疾病的发病过程［3］。在肿瘤细胞中，NF-κB可以调节许多基因，包括增殖相关基因(cyclinD1，COX2，and c-Myc)、抗凋亡相关基因(survivin，Bcl-2)、侵袭相关基因(MMP-9 and ICAM-1)等［4］。本实验发现，NF-κB在结直肠癌组织中的阳性表达率为58.46%，与对照非癌组织的阳性率17.5%相比，差异有统计学意义。目前的研究发现，肿瘤的凋亡抑制可能在结直肠癌的发生、发展及转移中起重要作用［5］。

Survivin是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子，可抑制多种刺激因素诱导的凋亡，使细胞存活，有利于细胞的异常增殖和恶性转化，进而导致肿瘤的发生［6］。Survivin可能通过下列途径抑制细胞凋亡:(1)抑制凋亡终末效应蛋白 caspase-3、caspase-7的活性，从而有效的阻断细胞凋亡过程［7］。(2)与细胞周期调控因子周期蛋白激酶CDK4形成复合体，使 p21从CDK4复合体中释放出来，并移位到线粒体中与caspase3特异性结合，间接抑制caspase3活化，阻止线粒体释放细胞色素 C，从而起到抗凋亡作用［8］。本研究发现，Survivin在结直肠癌组织中的表达阳性率为72.31%，与对照非癌组织相比，差异有统计学意义。

本实验也证实在结直肠癌组织中，Survivin与NF-κB之间表达呈显著正相关(r=0.75)。并且 Survivin、NF-κB蛋白在结直肠癌组织中的表达与癌组织的分化程度、淋巴结转移和Dukes分期相关(P＜0.01)，说明 NF-κB及 Survivin在结直肠癌的发生、发展及转移中起着重要作用。

1 Weir HK，Thun MJ，Hankey BF，et al.Annual report to the nation on the status of cancer，1975-2000，featuring the uses of surveillance data for cancer prevention and control.J Natl Cancer Inst，2003，95:1276-1299.

2 Kawasaki H，Altieri DC，Lu CD，et al.Inhibition of apoptosis by survivin predicts shorter survival rates in colorectal cancer.Cancer Res，1998，58:5071-5074.

3 KarinM.NF-kappa B and cancer:mechanisms and targets.Mol Carcinog，2006，45:355-361.

4 Yang P，Guo L，Duan ZJ，et al.Histone Methyltransferase NSD2/MMSET Mediates Constitutive NF-κB Signaling for Cancer Cell Proliferation，Survival，and TumorGrowth via a Feed-Forward Loop.Mol Cell Biol，2012，32:3121-3131.

5 Yoriaki S，Takehiko K，Takashi Y，et al.The incidence of apoptosis during colorectal tumorigenesis.Int J Surg Pathol，2000，8:123-132.

6 Angela F，Natalie R，Sam W，et al.Survivin，a member of the inhibitor of apoptosis family，is iInduced by photodynamic therapy and is a target for improving treatment response.Cancer Res，2007，67:4989-4995.

7 Suzuki A，Ito T，Kawano H，et al.Survivin initiates procaspase 3/p21complex formation as a result ofinteraction with cdk4 to resist Fas-mediated cell death.Oncogene，2000，19:1346-1353.

8 Sah NK，Khan Z，Khan GJ，et al.Structural functional and therapeutic biology of Survivin.Cancer Lett，2006，244:164-171.