右旋柠檬烯的研究进展及其新型专利技术

李思思，王 涛，董志红，和琳琳，高艺歌

(1.河南省康利医药技术开发有限公司 河南郑州 450044;2.河北工程大学医学院附属医院 河北邯郸 056002;3.河北工程大学医学院 河北邯郸 056002;4.郑州圣华药物食品技术开发有限公司 河南 郑州 450044)

柠檬烯是一种天然的功能性单萜化合物，广泛地存在于很多具有芳香性的植物中，是分布最广的萜烯类化合物。柠檬烯具有三种空间异构体，分别是右旋柠檬烯、消旋柠檬烯、左旋柠檬烯，其中右旋柠檬烯不仅是自然界中存量最多的，也是被广泛应用和药理活性最突出的。

1 右旋柠檬烯的用途

右旋柠檬烯多年来常作为香料用于食品添加剂、天然洗涤剂、驱虫剂以及在油漆中作为溶剂［1-2］。也可作为原料制备成1，2环氧化物［3］、1－甲基－4－乙酰基－1－环己烯［4］等基础化学中间体物质。医药领域中，柠檬烯在临床上被用来作为治疗胆囊炎的药物已在我国批准上市。另外右旋柠檬烯还具有镇静中枢神经［3］、抑制胃食管反流和促进胃肠健康蠕动、溶解胆结石、缓解心绞痛［5］、抗菌［6］等作用。

2 右旋柠檬烯的抗肿瘤活性

近年来，许多研究者对右旋柠檬烯在临床上的抗肿瘤活性进行了深入地研究，现将研究进展总结如下。

Jia S S等［7］研究了体外右旋柠檬烯对结肠癌细胞生存能力的作用以及它潜在的行为机制。研究发现右旋柠檬烯以剂量依赖性的方式活化caspase-3和-9(半胱天冬酶-3和9)和多聚ADP-核糖聚合酶的分裂，以剂量依赖性的方式抑制LS174T细胞的生存能力，并且引起剂量依赖性的细胞凋亡。

Chidambara Murthy K N等［8］从血橙中获得的主要成分是右旋柠檬烯的挥发油，将其制成乳剂，并检查它对结肠癌细胞生存能力的影响。研究结果显示其对结肠癌细胞有剂量－依赖性抑制细胞增殖和诱导结肠癌细胞凋亡作用，可能在预防癌症上具有巨大的潜力。Jamia Hamdard 等［9］研究了右旋柠檬烯对于由7，12-二甲基苯蒽(DMBA)-发起的以及12-O-十四烷酰佛波醋酸酯-13(TPA)-促进的皮肤肿瘤发展的作用。他们发现右旋柠檬烯对小鼠皮肤的治疗明显地减少TPA-诱导的①水肿和增生(P＜0.01);②环氧合酶-2的表达;③鸟氧酸脱羧酶的活性(P＜0.01);④［(3)H］胸腺嘧啶脱氧核苷合并入DNA(P＜0.01)。在二期皮肤肿瘤研究中，与DMBA/TPA-处理过的鼠相比较，右旋柠檬烯显著地减少了肿瘤负担(P＜0.05)和肿瘤发生率。Thangaiyan Rabi等［10］探索着去定性是否非毒性剂量的右旋柠檬烯可以提高转移性前列腺癌的体外模型中肿瘤对紫杉萜的响应。研究结果显示，右旋柠檬烯提高紫杉萜抗前列腺癌细胞的抗肿瘤效果，对正常的前列腺上皮细胞没有毒性。右旋柠檬烯能够用来做为一种潜在的无毒剂来提高用紫杉萜对于激素非依赖性前列腺癌的治疗效果。

徐耀庭等［11］探讨了右旋柠檬烯对人膀胱癌EJ细胞生长和ras p21表达的影响。研究结论认为，右旋柠檬烯对EJ细胞生长具有明显的细胞毒作用，并呈一定的量效关系。徐耀庭等［12］于2010年再次发表文章论述道，右旋柠檬烯对人膀胱癌EJ细胞具有显著的抑制作用，它还能使EJ细胞停滞于S期，并能诱导细胞凋亡。杨真等［13］的研究结果证明右旋柠檬烯能够诱导人白血病细胞凋亡，线粒体凋亡的激活可能是凋亡诱导的主要机制。王金香等［14］的研究发现右旋柠檬烯可以引起细胞内活性氧(ROS)的蓄积，线粒体膜电位(MMP)的下降和Caspase-8活化。右旋柠檬烯诱导的HL-60细胞凋亡机制是通过活性氧非依赖的Caspase-8活化来实现的。王玲等［15］的研究结果显示，右旋柠檬烯可以引起MGC803细胞凋亡，且呈时间依赖性。发现右旋柠檬烯处理的细胞内ROS明显升高(P＜0.05)，caspase-3蛋白表达明显增加(P＜0.05)。她们认为，右旋柠檬烯能有效地抑制癌细胞的生长以及诱导凋亡。

右旋柠檬烯祛痰、止咳、平喘的作用机理也正在被逐步揭示。内蒙古大学动物科学与技术学院的Chi G等［16］进行的研究显示，右旋柠檬烯减少LPS-诱导的明显肺组织病理学改变，肺湿－比－干的重量比率，以及肺绿过氧物酶的活性。另外，用柠檬烯预处理抑制BALF中的炎症细胞和促炎因子包括肿瘤坏死因子－α、白细胞介素-1β、以及白细胞介素-6。结果表明，柠檬烯保护性的作用机制可能部分地归因于通过抑制NF-κB和MAPK的活性而减少促炎因子的产生。

一篇综述性文献对右旋柠檬烯的抗癌作用有概括的表述［5］。动物研究已确定右旋柠檬烯对几种类型的癌症有化学保护活性的阶段。实验证实了在啮齿类动物中服用橘皮或纯的右旋柠檬烯能抑制化学诱导的乳腺癌。其它的动物实验证明右旋柠檬烯能抑制肝癌、肺腺瘤、前胃肿瘤的发展。研究发现右旋柠檬烯通过增加细胞凋亡，同时减少癌症细胞的DNA合成和鸟氨酸脱羧酶的活性来减少胃癌。右旋柠檬烯通过抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，以及阻塞致癌基因的表达抑制肝癌的形成。右旋柠檬烯也显示出免疫调节的性质。

3 讨论

3.1 柠檬烯制剂存在的问题 综上所述，右旋柠檬烯在临床上，尤其是抗肿瘤的方面具有突出的作用。尽管目前我国只是把柠檬烯(混合体)作为治疗胆囊炎的药物批准上市，但随着右旋柠檬烯基础研究的深入，更为广泛的临床应用将会被不断拓宽。要实现这个目标，其中最重要的问题就是对现有柠檬烯制剂的产品质量进行提升。然而已经获得上市的柠檬烯口服制剂的产品质量并不令人乐观，主要存在以下2个问题。①柠檬烯原料没有被规范地确定为右旋柠檬烯并且应该具备相应的高纯度，被获准应用于临床的是柠檬烯3种空间异构体以及杂质的混合物。根据我国颁布的柠檬烯原料质量标准［17］，含量确定为柠檬烯，没有区分3种空间异构体，且含量仅为80%。作为柠檬烯药物制剂的柠檬烯胶囊的质量标准［18］，由于受柠檬烯原料质量标准的限制，其有效成分也仅以柠檬烯混合物确认。②制剂的质量不稳定。目前我国被批准上市的是柠檬烯胶囊，是采用没有被纯化的柠檬烯原料与淀粉的混合颗粒物填充到硬胶囊壳中。由于柠檬烯所具有的挥发性，这种药物制剂在生产出来之后，随着贮藏时间的延续和贮藏环境温度的变化，混杂在淀粉颗粒被填充在硬胶囊中的柠檬烯一方面会被氧化，另一方面会挥发出来，使得制剂的质量发生改变。

由于存在上述2种问题，不能从根本上保障柠檬烯制剂的产品质量，也就无法确保已经批准适应症(利胆药)的有效治疗，更无法给柠檬烯临床扩展应用提供稳定的药物和制剂基础。

3.2 柠檬烯的新型专利技术 笔者及与之合作的研究人员所申报的柠檬烯制剂的发明和实用新型工艺专利日前首先得到了国家知识产权局的实用新型专利授权，其发明专利正处于审查过程之中。现将工艺专利的技术要点表述如下。

根据已有的上述研究文献可知，右旋柠檬烯不仅具有挥发性，且容易被氧化。在大气中，柠檬烯和其它的萜烯快速进行光化学反应生成羟基、硝酸自由基和臭氧。右旋柠檬烯暴露于空气中形成的D-柠檬烯的氢过氧化物和其他的氧化产物已被证明是有效的接触致敏原。而未氧化的D-柠檬烯没有任何致敏作用。针对这个特点，该制备技术分两个部分。①制备工艺的改变。该技术采用直接将柠檬烯液体灌装在硬胶囊中的填充方式。同时对胶囊填充剂的填充部位进行低温和充氮保护，以避免柠檬烯在胶囊填充的过程中与空气接触而产生氧化降解。不仅可以在制备过程中防止柠檬烯的氧化确保填充到硬胶囊壳中柠檬烯的质量，也可以保护生产工人不对氧化后的柠檬烯过敏，提高了生产的安全性。②对填充后的硬胶囊进行包衣或对胶囊接口处进行胶带封口密封以防止柠檬烯在贮藏的过程中挥发溢出而降低柠檬烯的含量。

按照上述工艺的基本原理可制备成柠檬烯硬胶囊剂。如果采用一般胶囊规格生产的这种制剂可以作为人用药品取代目前的柠檬烯胶囊产品。如果采用00号胶囊壳或特制的内容量更大一些的硬胶囊壳，则这种制剂可以作为一种便携式清洗剂，用于小面积油污、墨迹、粘胶等的清洗，不仅方便，也安全。

［1］王德明，朱志良.三氯乙烯替代品-右旋柠檬烯的应用研究［J］.实用预防医学，2006，13(4):1032-1033.

［2］李小玉，陈静静.一种含D-柠檬烯的油墨清洗剂的研制［J］.日用化学工业，2010，40(3):178-180.

［3］尹显洪，杨仕平，杨满芽.柠檬烯选择性环氧化的研究进展［J］.化学试剂，1998，20(5):267-269.

［4］杨始刚，嵇金丽，戴莹，等.从柠檬烯合成1-甲基-4-乙酰基-1-环己烯的研究［J］.广州化工，2009，37(3):118-119.

［5］Sun J.D-Limonene:Safety and Clinical Applications［J］.Altern Med Rev，2007，12(3):259-264.

［6］王雪梅，谌徽，李雪姣，等.天然活性单帖-柠檬烯的抑菌性能研究［J］.吉林农业大学学报，2010，32(1):24-28.

［7］Jia S S，Xi G P，Zhang M，et al.Induction of apoptosis by D － limonene is mediated by inactivation of Akt in LS174T human colon cancer cells［J］.Oncol Rep，2013，29(1):349-354.

［8］Chidambara Murthy K N，Jayaprakasha G K，Patil B S.D－limonene rich volatile oil from blood oranges inhibits angiogenesis，metastasis and cell death in human colon cancer cells［J］.Life Sci，2012，91(11-12):429-439.

［9］Jamia H，Siddiqui M S，Athar M，et al.D－Limonene modulates inflammation，oxidative stress and Ras-ERK pathway to inhibit murine skin tumorigenesis［J］.Hum Exp Toxicol，2012，31(8):798-811.

［10］Rabi T，Bishayee A.D-Limonene sensitizes docetaxel－induced cytotoxicity in human prostate cancer cells:Generation of reactive oxygen species and induction of apoptosis［J］.J Carcinog，2009，8:1-9.

［11］徐耀庭，顾炜，刘江霞，等.D－柠檬烯对人膀胱癌细胞生长和ras p21表达的影响［J］.中华泌尿外科杂志，2008，29(12):808－810.

［12］徐耀庭，李劲松，顾炜，等.D－柠檬烯诱导人膀胱癌细胞周期阻滞及凋亡的研究［J］.中国医学工程，2010，18(3):6-9.

［13］杨真，纪军，刁凤声.右旋柠檬烯诱导人白血病细胞凋亡作用机制的初步探讨［J］.肿瘤，2008，28(11):938-941.

［14］王金香，张玉祥.D－柠檬烯诱导白血病细胞凋亡的机制研究［J］.科技资讯，2010，(5):6-9.

［15］王玲，张秀珍.D－柠檬烯对人胃癌MGC803细胞株增殖和凋亡的影响［J］.生命科学仪器，2009，7(1):26-28.

［16］Chi G，Wei M，Xie X，et al.Suppression of MAPK and NF － κB pathways by limonene contributes to attenuation of lipopolysaccharideinduced inflammatory responses in acute lung injury［J］.Inflammation，2013，36(2):501-511.

［17］国家食品药品监督管理局.柠檬烯原料质量标准［S］.WS-10001-(HD-0535)-2002.

［18］国家食品药品监督管理局.柠檬烯胶囊质量标准［S］.WS-10001-(HD-0536)-2002.