CASP8 基因多态性与食管鳞癌淋巴结转移易感性的关系

王 旭，顾海勇，尹 俊，朱静峰，唐巍峰，陈锁成

(江苏大学附属人民医院，江苏镇江 212002)

死亡受体通路是介导肿瘤浸润T 淋巴细胞发生激活诱导的细胞凋亡［1］(AICD)的关键路径，参与人类肿瘤免疫过程。该通路及其调节基因存在遗传变异时，可能会影响个体免疫状态而改变个体的肿瘤易感性。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8(CASP8)是死亡受体凋亡通路的重要起始型蛋白酶，只有当CASP8 被死亡信号募集并活化后，才能激活下游效应型蛋白酶，最终使细胞凋亡［2］。研究显示，CASP8 mRNA 和CASP8 蛋白在食管鳞癌组织中表达明显下调，提示CASP8的表达失调与食管癌的发生发展密切相关［3～5］。已知基因的单核苷酸多态性可以影响基因的表达水平及蛋白酶的功能，因此，我们对CASP8 基因多态性和食管癌淋巴结转移易感性进行了研究。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2008年10月～2009年11月就诊江苏大学附属人民医院、江苏大学附属医院的食管癌患者355例，术前胃镜及术后病理检查均确诊为鳞状细胞癌。术中取淋巴结进行病理检查，分为淋巴结转移组85例和无淋巴结转移组270例。淋巴结转移组中，男62例、女23例，年龄(61.85±7.07)岁，吸烟39例、不吸烟46例，饮酒30例、不饮酒55例;无淋巴结转移组男187例、女83例，年龄(63.21±8.76)岁，吸烟107例、不吸烟163例，饮酒87例、不饮酒183例。两组性别、年龄、吸烟及饮酒状况比较无统计学差异(P＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 CASP8 基因多态性检测 在获得患者及家属书面知情同意书后，空腹采集静脉血2 mL，EDTA抗凝血，1 h 内4 000 r/min 离心10 min，分离白细胞层，采用Qiagen DNA 提取试剂盒提取DNA。基因分型采用上海天昊生物技术有限公司自主专利开发的2 ×48 位SNPscanTM高通量基因多态性分型技术。基于5'端及3'端双侧探针连接反应及多重荧光PCR 扩增、电泳分离从而获取各基因多态性位点的基因型。实验条件根据制造商说明书设定。首先，将100～200 ng DNA 样本置于10 μL 含有1 ×DNA裂解缓冲液的反应体系中，98 ℃、5 min 变性裂解，然后将其与10 μL 含有2 μL 10 ×连接酶缓冲液、0.5 μL连接酶、1 μL 混合探针以及7.5 μL Mili-Q水的连接预混液充分混合。连接反应在ABI2720热循环仪内完成，采用以下反应条件:4个循环(94℃1 min，58 ℃4 h)，94 ℃2 min，温度控制在4℃并且立即加入20 μL 2 ×终止缓冲液停止反应体系。每一个连接产物都采用2 ×48 位荧光PCR 反应扩增。PCR 反应体系为20 μL 混合液，其中包括1 ×PCR 预混液，1μL PCR 引物和1 μL 连接产物。PCR 反应体系为:95 ℃2 min，94 ℃20 s，9个循环;65 ℃、40 s，72 ℃、1.5 min，94 ℃、20 s，25个循环;57 ℃、40 s，72 ℃、1.5 min，60 ℃、1 h，最后恒温在4 ℃。PCR 产物分离和检测由毛细管电泳法在ABI3730XL 测序仪上检测，原始数据分析和基因型判别由GeneMapper4.0 完成。

1.2.2 统计学方法 采用SPSS13.0 统计软件;单因素和多因素Logistic 回归分析计算优势比(OR)及其95%可信区间(CI)判定CASP8 基因多态性与食管癌淋巴结转移易感性的关系。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

淋巴结转移组有83例(97.6%)基因分型成功，无淋巴结转移组有259例(95.9%)基因分型成功。CASP8 rs1035142 G＞T 三种基因型GG、GT、TT 在淋巴结转移组和无淋巴结转移组的频率分布分别为31.3%、53.0%、15.7%和42.9%、40.9%、16.2%，组间比较无统计学差异(χ2=4.192，P=0.123)。单因素Logistic 回归分析发现，以GG 基因型作为参照，携带CASP8 rs1035142 GT 基因型的食管鳞癌患者淋巴结转移风险升高(OR=1.77，95%CI=1.02～3.08，P=0.04)。多因素Logistic 回归发现，在调整了年龄、性别、吸烟及饮酒状况后，携带GT 基因型的个体淋巴结转移风险依旧比携带GG基因型的个体高(调整OR=1.77，95% CI=1.02～3.09，P=0.04)。但这种变化并不与个体携带突变基因的个数呈剂量依赖效应，在结果中没有发现突变纯合TT 基因型与食管鳞癌淋巴结转移风险有相关性(P=0.49)。在显性模型分析中，调整了年龄、性别、吸烟及饮酒状态后，以CASP8 rs1035142 GG作为参照，GT +TT 基因型没有明显增加患者淋巴结转移风险(调整OR=1.64，95% CI=0.97～2.78，P=0.07)。隐性模型中调整了年龄、性别、吸烟及饮酒状态后，相对于GG +GT 基因型，未发现CASP8 rs1035142 TT 基因型与食管鳞癌淋巴结转移易感性存在关联(调整OR=0.95，95% CI=0.48～1.88，P=0.89)。

3 讨论

由于食管周围存在复杂的淋巴系统，晚期食管鳞癌患者从颈部至腹腔都可以发生淋巴结转移［6，7］。现有的检查技术很难发现微小的淋巴结转移灶，无法准确判断食管鳞癌患者的TNM 分期，从而影响了个体化治疗方案的制定和实施。因此，亟需发现一种新型可靠的检查方法来准确评估患者淋巴结转移情况。

Motoyama 等研究发现，急性反应蛋白1846 C＞T 基因多态性是食管鳞癌淋巴结转移易感性的独立影响因素，携带突变基因型的患者淋巴结转移风险显著增加;将检测该多态性位点和传统检查技术相结合，可使诊断淋巴结转移的准确性大大提高。因此我们推想从遗传学角度研究淋巴结转移的潜在机制，并从分子水平对淋巴结转移情况作出评估，可以达到早期发现、个体化治疗甚至预防淋巴结转移的目的。

有文献报道，在胃癌患者中有淋巴结转移者的CASP8 mRNA 和CASP8 蛋白的表达显著低于无淋巴结转移者［8］，而基因多态性可以影响基因的表达水平及蛋白酶的功能，我们猜测淋巴结转移机制可能与CASP8的基因多态性有关。编码CASP8的基因位于人类染色体2q33，由11个外显子组成，在其29.68 kb 长度的DNA 双链上存在1 000 多个突变位点，具有高度的多态性。Wu 等［9］发现，CASP8 rs1035142 位点多态性与食管腺癌的发生显著相关。因此我们选择了CASP8 rs1035142 G＞T 作为研究靶点，探讨其与食管鳞癌淋巴结转移易感性的关系。结果提示，CASP8 rs1035142 GT 基因型可增加食管鳞癌患者淋巴结转移风险，可能是影响淋巴结转移易感性的一个独立因素。尽管本研究提示，CASP8基因多态性与食管鳞癌淋巴结转移有关，CASP8 rs1035142 GT 基因型可能是食管鳞癌淋巴结转移的易感因素。但是本研究也存在不足之处，主要表现为:①除基因多态性外，RNA 干扰、基因甲基化和表达异常也可以引起CASP8 基因的低表达或不表达;②淋巴结转移的生物学过程很有可能是由多基因共同作用的结果;③未行单倍型分析，单基因位点并不能完全代表该基因区域的功能，单倍型分析对个体易感性评价更准确;④样本量有限，统计学效能不高。因此，CASP8 基因多态性与食管鳞癌淋巴结转移的关系还需对多态性位点进行多中心的大样本研究。

［1］Green DR，Droin N，Pinkoski M.Activation-induced cell death in T cells［J］.Immunol Rev，2003，193(0):70-81.

［2］Nagata S.Apoptosis by death factor［J］.Cell，1997，88(3):355-365.

［3］薛丽艳，任立群，罗巍，等.FAS、FAS 配体、FAS 相关死亡结构域蛋白、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8 和突变型P53 蛋白在食管鳞癌患者中的表达［J］.中华医学杂志，2007，87(3):150-154.

［4］张晓峰，陈幕华，陈萍萍，等.食管癌组织中Caspase-8 表达及临床意义［J］.山东医药，2008，48(38):21-23.

［5］崔玲玲，李春阳，王旗，等.食管鳞癌组织中EphrinB2、半胱氨酸蛋白酶8 蛋白和mRNA的表达［J］.郑州大学学报，2010，41(5):21-23.

［6］Shimada H，Okazumi S，Matsubara H，et al.Impact of the number and extent of positive lymph nodes in 200 patients with thoracic esophageal squamous cell carcinoma after three-field lymph nodedissection［J］.World J Surg，2006，30(8):1441-1449.

［7］Xu QR，Zhuge XP，Zhang HL，et al.The N-classification for esophageal cancer staging:should it be based on number，distance，or extent of the lymph node metastasis［J］.World J Surg，2011，35(6):1303-1310.

［8］沈俊俊，潘月芬，钟丽萍，等.胃癌组织中半胱氨酸蛋白酶-8的表达及临床意义［J］.中国医师杂志，2012，14(2):166-169.

［9］Wu IC，Zhao Y，Zhai R，et al.Association between polymorphisms in cancer-related genes and early onset of esophageal adenocarcinoma［J］.Neoplasia，2011，13(4):386-392.