南方水稻黑条矮缩病研究进展

沈灿章

(湖南农业大学植物病虫害生物学与防控湖南重点实验室，湖南 长沙 410128)

南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black–streaked dwarf virus，SRBSDV)作为一种新近流行的大范围爆发的病毒受到人们广泛的关注。有研究[1–5]表明，其病原基因组含10条片段，属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)、斐济病毒属(Fijivirus)。该病害在2001年首次发现，近年来，我国南方以及越南北部的水稻种植区发生严重，尤其是2009年暴发成灾。到目前为止，中国已有35个省市以及越南有过该病害发生的报道。该病害危害的症状与20世纪60年代和90年代报道的水稻黑条矮缩病毒有所区别，其分布和流行区域相比普通水稻黑条矮缩病更易出现于中国南端。

1 典型症状

水稻黑条矮缩病在水稻各生育期均可感染，并且不同生长期都有其典型的症状，其症状表现为植株矮缩、叶色深绿、叶背及茎秆出现条状乳白色或深褐色小突起、高位分蘖及茎节部倒生气生须根，其中高位分蘖及茎节部气生须根倒生这两点有别于普通水稻黑条矮缩病的症状。观察发现，高位分蘖和有倒生根症状的病株进行多次重复的和带有对照的RT–PCR检测都是呈现SRBSDV阴性，表现茎秆上白色突起症状的病株都呈SRBSDV阳性，由此可见，高位分蘖和倒生根不是SRBSDV的典型症状，只有茎上白色突起才是南方水稻黑条矮缩病的独特症状。由于水稻不同生育期都可以感染SRBSDV，并且可能出现不同病毒病或真菌病害混合侵染的情形，到目前为止还没有一套完整的症状描述标准从症状上将SRBSDV与其他病害区分开来。本实验室研究显示，SRBSDV症状易与普通黑条矮缩病RBSDV症状相混淆，即病株矮缩、病株叶顶端螺旋状卷曲、病叶僵直扭曲、有不规则凸起或凹陷、发病严重的病株不抽穗，但感染SRBSDV的植株一般在茎节处有倒生根且茎上出现白色烛泪状突起。另外，感染RBSDV的病株也有表现出类似于水稻黄矮病叶片发黄、分蘖伸展角度大、株形松散的症状。本课题组曾对一些呈现如叶尖旋迭、叶片螺旋、叶片上窗格状皱缩、整叶螺旋紧裹、叶脉扭曲的症状的病株，用SRBSDV特异性专利引物多次重复下的RT–PCR检测呈现阳性。而一些表现出SRBSDV症状如典型的窗格状皱缩，有时并不是由于SRBSDV感染所致，也可能由药害引起，如多效唑药害。

2 寄主和传播介体

周国辉等[3]报道南方水稻黑条矮缩病可危害水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、薏米(Coix chinensis)、稗草(Echinochloa crusgalli)、白草(Echinochloa crusgalli)和水莎草(Juncellus serotins)和异形莎草(Cyperus difformis)等多种作物与杂草。对采集于湖南省各地发病田块附近禾本科作物及杂草的RT–PCR检测中，发现SRBSDV可以感染高粱、野燕麦、牛筋草。自然感染该病害的寄主中玉米症状比较明显，如矮缩、叶面皱褶和叶色深绿，而其他寄主症状不明显。与RBSDV主要靠灰飞虱介体传播不同的是，SRBSDV在自然条件下靠白背飞虱传播，但室内灰飞虱也能以较低的效率传播，这也是SRBSDV与RBSDV在流行上最显著的差别所在。也有研究[6–9]证实南方水稻黑条矮缩病毒不经水稻种子传播，这正好符合斐济病毒属染病植株的韧皮部，不能通过机械摩擦传染的特征。目前主要认可的传毒介体为白背飞虱，由于白背飞虱的迁飞性，春季带毒白背飞虱成为春季的初侵染源，经过当地早稻或其他寄主植物的繁殖，进一步危害中晚稻，因此，被带毒的白背飞虱侵染的水稻是下一代SRBSDV爆发的侵染源。

目前，SRBSDV的爆发情况与白背飞虱的流行状况密切相关，防治条件必须立足于白背飞虱的防治。随着SRBSDV新的寄主的发现，将能为预测病害流行和切断白背飞虱的传毒链，有效控制该病毒病的流行蔓延提供更多依据。

3 基因组序列

关于SRBSDV序列分析主要用于病原的鉴定和株系分类上的比较，以及进一步研究该病毒的进化和变异。目前已有广东和海南以及越南的SRBSDV全序列测定，在与斐济病毒属内其他病毒成员的全序列对比时发现，与其亲缘关系最近的是与其核苷酸同一率达70%以上的水稻黑条矮缩病毒，其次是马德里约柯托病毒和斐济病病毒。在序列比对时发现，根据各自基因组片段编码功能的不同呈现出不同的同一性，与RBSDV相比，S1，S2 和 S10 相对保守，而S5和S6是最不保守的，这也说明了斐济病毒科中各条片段是独立进化的。相对保守的片段功能一般关系到病毒的复制和适应性，而相对多样性的片段可能决定了病毒的寄主范围及致病性。

有研究发现RBSDV的S6编码沉默抑制子，也有在分析中发现S6是基因组片段中最不保守的，牛颜冰等[5]用农杆菌介导的瞬时抑制分析法，证明了SRBSDV的S6编码一个沉默抑制子具有抑制基因沉默的作用。利用昆虫表达的杆状病毒在昆虫细胞中表达，发现其形成与病毒侵染时产生的相类似的微管结构，验证了生物信息预测到其具有自身互作的功能。所以，病毒进化上各个片段的相对独立性使得根据不同地理环境不同寄主上个别片段的差异来分析病毒的致病性和寄主的变化的关系成为可能。

4 病毒检测技术

干扰SRBSDV识别的病毒主要是RBSDV，由于SRBSDV与RBSDV在症状、寄主范围和传播介体以及两种病毒粒子在形态结构上具有相似性，使得一般的生物学和电镜的观察鉴定较为困难。

在血清学检测上，前人研究[10–12]表明，用原核表达技术表达RBSDV S8和S9的编码蛋白用Western blot可见到病株上相应蛋白，制备RBSDV特异性抗血清用ELISA检测到病株上的该病毒，为RBSDV的血清学快速检测提供了条件。除此之外，还可以将血清学与PCR检测的方法结合起来，如制备RBSDV 外壳蛋白的多克隆抗体建立了Dot–blot ELISA和免疫捕获RT–PCR等检测方法。为了增强血清学反应的特异性，用来制备抗血清的免疫原必须尽可能的单一，在RBSDV的血清学检测中，因为其含有多个结构蛋白，用来制备抗血清使得其与多个结构蛋白反应，而且由于RBSDV外壳蛋白和表面突起的不稳定性，很难提取完整的病毒粒子，所以要获得高特异性的抗血清，通过原核表达病毒的特异性蛋白是必须的手段，SRBSDV全基因组序列的测定，对编码蛋白质的序列的获得与分析为利用单个高含量且特异性的免疫原而获得特异性抗血清提供了可能，但目前应用于RBSDV上的血清学检测技术由于因抗血清效价和特异性较低等问题并未广泛应用。

目前，SRBSDV 的检测方法主要是RT–PCR，周国辉等[3]建立巢式RT–PCR检测技术对SRBSDV进行检测，周倩等通过SRBSDV的S10序列设计引物能一步法RT–PCR快速检测SRBSDV，相对减少了实验步骤，缩短了检测时间。运用RT–PCR对RBSDV的检测也是比较常见的方法。季英华等[12]报道了一种加入3条引物只需一次RT–PCR ，即可实现对SRBSDV和RBSDV同时检测与鉴别的方法。现有研究报道显示，开发基于YBR Green I的一步法检测SRBSDV 的方法，其灵敏度较之传统的RT–PCR方法提高了100倍。利用RT–LAMP技术能够从来源于带毒寄主和介体的提取的最低达1.2 × 10-6μg的总RNA中检测出SRBSDV，并且可以区别于RBSDV，该技术使用方便，费用低灵敏度高，适于运用，但操作过程中要克服其环境中和实验器材上病毒核酸的污染。

[1]陈声祥，张巧艳．我国水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病研究进展[J]．植物保护学报，2005，32(1)：97–103．

[2]Zhou G H，Wen J J，Cai D J，et al．Southern rice black– streaked dwarf virus：A new proposed Fijivirus species in the family Reoviridae [J]．Chinese Science Bulletin，2008，53(20)：2500–2508．

[3]周国辉，张曙光，邹寿发，等．水稻新病害南方水稻黑条矮缩病发生特点及危害趋势分析[J]．植物保护，2010，36(2)：144–146

[4]Matsukura K，Towata T，Sakai J，et al．Dynamics of Southern rice black–streaked dwarf virus in rice and implication for virus acquisition[J]．Phytopathology，2013，103(5)：509–512．

[5]牛颜冰，青玲，王德富，等．植物病毒抑制子抑制RNA沉默的机制及生物学应用[J]．分子植物育种，2009，7(1)：137–142．

[6]陈声祥，张巧艳．我国水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病研究进展[J]．植物保护学报，2005，32(1)：97–103．

[7]龚祖埙，沈菊英，陈巽祯，等．玉米粗缩病病原的研究[J]．生物化学与生物物理进展，1981，13(1)：55–60．

[8]周益军，范永坚，程兆榜，等．玉米粗缩病的发生与病原初步鉴定[J]．江苏农业学报，1998，14(4)：246–248．

[9]吴淑华，王朝辉，范永坚，等．江苏省玉米粗缩病病原病毒的RTPCR检测[J]．农业生物技术学报，2000，8(4)：369–372．

[10]王朝辉，周益军，范永坚，等．从单头灰飞虱中检测水稻黑条矮缩病毒简单快速的方法[J]．上海交通大学学报：农业科学版，2002，20(4)：340–343．

[11]吕永平，雷娟利，金登迪，等．水稻黑条矮缩病毒的RT–PCR检测[J]．浙江农业学报，2002，14(2)：117–119．

[12]季英华，高瑞珍，张野，等．一种快速同步检测水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的方法[J]．中国水稻科学，2011，25(1)：91–94．