应用胚胎移植技术培育SPF级小鼠的研究进展

刘 伟 陶芳标 黄德武 王晓红

(安徽医科大学实验动物中心 安徽合肥 230032)

无特定病原体(Specific Pathogen Free，SPF)小鼠因为不携带主要潜在感染和条件致病菌以及对科学实验干扰大的病原体而成为国际公认的标准级别的实验动物，如何完成普通级小鼠向SPF级小鼠的生物净化是近年来实验动物工作者不断探索的课题，从最初的药物净化尝试到传统的剖腹产净化再到胚胎移植，小鼠的生物净化技术得到了长足的发展，实践证明新兴发展起来的超数排卵-体外受精-胚胎移植技术具有来源清晰，遗传背景明确，胚胎数量充足的优点，并且可以避免病毒、遗传疾病通过胎盘传染仔鼠，是净化种群的理想方法［1］，现就该技术予以综述。

1 胚胎移植技术培育SPF级小鼠的原理

胚胎移植(Embryo Transfer，ET)又称受精卵移植，它是将体内、外生产的小鼠早期胚胎移植到生理状态相同的小鼠生殖道内，使之继续发育成正常个体的生物技术。母鼠在发情后，其生殖系统均处于相同的生理状态之下，不论受精与否，卵巢都要经历排卵、黄体形成、孕酮分泌、子宫内膜增生、分泌机能增强等相同的生理过程，妊娠和未孕并无区别。所以只要发情后未配种的受体母鼠所处的发情周期与移植的胚胎相近，胚胎便可在的其生殖道内继续发育并附植;其次，胚胎附植之前处于游离状态下离开母体，在短时间内可以存活并能进行体外培养，当重新回到与供体相同的环境中可以继续发育并发出妊娠信号，与受体母鼠建立生理上的联系，从而保证以后的正常发育;另外，受体母鼠对于具有外来抗原物质的同种胚胎和胎膜组织一般不存在免疫排斥反应［2］。小鼠胚胎的透明带是一道天然屏障，能有效地防止细菌、病毒的侵入［3］，许多病原体(如淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒)不能穿过透明带，再加上胚胎在供体体内发育时间很短，有效的避免了病原体的垂直传播，同时胚胎移植的冲洗过程也有助于减弱或消除病原体的活力［4］，从而增大了对疾病净化的可能性，而SPF级受体小鼠保证了胚胎后期发育不受病原体感染［5］，这些条件为成功建立新的SPF级小鼠种群奠定了基础。

2 胚胎移植技术培育SPF级小鼠的发展现状

自20世纪50年代建立了受精卵和早期胚胎的采集技术之后，日本、美国率先利用胚胎移植技术培育出了SPF级动物，我国从上世纪80年代由蒋广泰等人开展了小鼠胚胎移植净化方面的尝试，在短短30多年的发展中，小鼠胚胎移植及相关技术的研究已相当成熟并在生物净化方面得到了大量运用，1995年刘恩岐等在未采用超数排卵的情况下，将普通级C57BL/6J近交系小鼠胚胎移植到SPF级NIH封闭群雌鼠的子宫角内获得成功，在对仔鼠进行了微生物学检测后证实，通过胚胎移植可以将普通级小鼠直接净化到SPF级。之后田小利采用输卵管伞部移植法也获得成功。1999年都同功等［6］尝试将胚胎移入输卵管壶腹部前端，这种方法的优点是不用撕开囊膜且膨大的壶腹部易辨认，胚胎进入输卵管后顺行进入膨大部和子宫继续发育，不易漏出和逆行。2005年李瑞生［7］利用胚胎移植技术对四种突变无毛小鼠和一种白内障小鼠的桑葚胚进行子宫内移植，建立了SPF级特种突变无毛小鼠和白内障小鼠的种质资源库，为今后更好地研究与开发利用这些种质资源提供了良好的研究平台。2009年刘丽均［8］采用体外受精-胚胎移植技术对L858R、TL小鼠、中华小家鼠和感染肺炎克来伯氏菌的Balb/c-nu裸鼠进行生物净化，成功建立了这些品系小鼠的SPF级种群，经检测，20多种急慢性传染病均未感染，仔鼠成活率高达40%。由于清除了疾病，SPF级小鼠的优良性状得以充分发挥，利用这种小鼠所开展的科研实验的准确性和敏感性大大提高。

3 胚胎移植净化技术的方法与优缺点

胚胎移植生物净化有两种方法，一种是从自然交配母鼠子宫中获取受精卵，然后移植到假孕母鼠体内，产仔后达到生物净化的目的，但是该方法需要较多的雌雄鼠，不够经济节约，同时获取的胚胎数量有限。另一种方法是采用超排技术，获得大量的卵，同时取1～2只雄鼠采集精子，进行体外受精，一次性获取大量胚胎，这种方法既节省了动物又加速了生物净化节奏。随着众多生育力和哺育能力低下的突变系小鼠和基因工程小鼠的不断涌现，体外受精卵移植生物净化技术的应用也显得越来越必要［9］。胚胎移植技术步骤主要包括供体和受体的准备、卵子和精子的采集、培养、移植和微生物检测等几个步骤，而按照胚胎发育的不同阶段，移植部位也不同，1、2细胞期胚胎在输卵管部移植［10］，8细胞期到囊胚期胚胎在子宫部移植。

3.1 经典胚胎移植技术

3.1.1 结扎雄鼠准备。选用6～8周龄的雄鼠，在移植前2～3周实施双侧输精管结扎手术，并在术后1周试交配一次以除去输精管中的余精。

3.1.2 供体小鼠的超数排卵。实验第1天15:00给3～5周龄供体雌鼠腹腔注射PMSG(5IU/只)，第3天14:00相同剂量注射HCG后立即与雄鼠1:1交配，第4天8:00～9:00检栓成功者作为移植供体。

3.1.3 假孕母鼠准备。实验第4天将受体雌鼠与结扎雄鼠2:1交配，次日8:00～9:00检栓成功者作为移植受体。目前国际上通用的受体母鼠是受孕能力较强、母性较好的ICR小鼠，我国所特有的KM小鼠从妊娠率及产仔率来看与ICR小鼠并无差异，因此KM雌鼠也有较好的受孕能力和代乳能力［11］。

3.1.4 受精卵采集。实验第5天颈椎脱臼处死供体母鼠，实施手术暴露子宫、输卵管、卵巢和脂肪垫，用剪刀将输卵管和卵巢分离，并将子宫角剪下，固定输卵管伞部，将吸有冲胚液的注射器插入伞部，推动注射器将输卵管及子宫内的胚胎冲出，用吸卵管将形态优良的胚胎挑出并在冲胚液中转移3次，最后用移植管吸入15～20枚胚胎备用。

3.1.5 胚胎移植。①输卵管膨大部移植法。将受体鼠置于超净台中麻醉，实施手术拉出卵巢、输卵管和子宫，移入显微镜下，在输卵管伞端至壶腹部之间靠近壶腹部1/3处的输卵管壁上用5号针头穿一小洞，并用镊子固定开洞附近边缘，把移植管插入洞口并将8～10枚2细胞期胚胎吹入输卵管膨大部，再将子宫、输卵管回位，同样方法移植另一侧输卵管后，缝合肌肉、皮肤，最后将受体鼠放在55℃热台上复苏后送回SPF级动物房待产仔。②输卵管伞口移植法。体视显微镜下拉出卵巢部，剪开卵巢膜，找到输卵管伞，将1细胞期胚胎经受体母鼠输卵管伞口移植入受体母鼠输卵管中。③子宫移植法。体视显微镜下拉出子宫，用显微镊子轻轻夹住子宫与输卵管结合部使子宫与鼠体成45°角，用5号针头在子宫壁穿一小洞，沿着针眼将移植管扎入并轻轻将8细胞期或囊胚期胚胎吹入子宫内，还纳子宫，缝合并消毒。

3.2 体外受精-胚胎移植技术

3.2.1 体外受精。取2～3只6～8周龄雄鼠，颈椎脱臼处死后打开腹腔，分离两侧睾丸及附睾，从附睾上体尾部挑出精子团块，移入HTF培养基中，置于37℃，5%的CO2培养箱获能2h。同品系母鼠超数排卵处理14h后颈椎脱臼处死，打开腹腔，分离输卵管，从输卵管壶腹部取出卵母细胞团，移入HTF微滴中，加入5～10μL精子(200个精子/μL)，放入CO2培养箱受精6h后洗卵，再培养过夜至2细胞期胚胎生成。研究结果表明，ICR、KM、CD1封闭群小鼠的体外受精率及形态正常的2细胞胚胎移植后的产仔率高于近交系小鼠和疾病模型小鼠［12］。

3.2.2 胚胎移植。2细胞期胚胎采用输卵管内移植法移植至假孕0.5d的母鼠输卵管内，两侧输卵管各移植8～10枚胚胎。

3.3 产仔及微生物检测 母鼠产仔后，哺乳到仔鼠离乳，随机抽取一只仔鼠和母鼠，按照GB/T18448·1-2001寄生虫学检测方法和GB14922·1-2001进行寄生虫学等级及监测;按照GB/T14926·42-2001细菌学检测方法和GB14922·2-2001进行细菌学等级及监测;按照GB/T14926·18～32;50～64-2001病毒学检测方法和GB14922·2-2001进行病毒学等级及监测。分离血清，用于病毒、细菌及寄生虫抗体检测。采集气管分泌物、肠内容物、脏器分离细菌，检测体内寄生虫。采集肛拭子进行细菌分离。根据微生物检测结果判定净化成功与否。

4 移植净化SPF级小鼠应注意的事项

4.1 胚胎的质量 优良胚胎的形态典型，卵细胞和分裂球的轮廓清晰，细胞质致密，色调和分布均一。通常封闭群和F1代雌鼠作为供体雌鼠时，因其杂交优势的体现，胚胎的质量和生命力高，异常卵比例低于各种近交系雌鼠的胚胎，且生育能力有所增强，产仔数多，因此移植成功率较高［13］。

4.2 胚胎存放时间 小鼠胚胎随着培养时间的延长其活力大大下降，因此胚胎在体外培养的时间愈短愈好。传统胚胎移植术则要求胚胎从输卵管冲出后尽快进行形态鉴定并捡洗胚胎，避免显微镜热灯光长时间的炙烤［14］。其次在冲胚液中要加入适量的新生牛血清以防胚胎下沉后与平皿底部贴壁。另外检洗胚胎的移植针断端应平整并将断口拂过火焰使其受热变光滑，这样在使用中不会划伤胚胎，也不会在虹吸时带入多余的液体。

4.3 供受体同步发情 供体小鼠发情与受体小鼠发情的同步性是决定胚胎能否移植成功的关键，理论上供体与受体的发情时间应完全同步，但是因为移植后的胚胎在受体鼠生殖道内有一定的恢复时间，所以一般受体鼠与结扎公鼠的合笼时间安排的比供体鼠的见栓时间晚12小时左右［15］。

4.4 无菌控制水平 在进行胚胎移植手术的整个过程中，一定要注意无菌控制，从小鼠的微生物级别、麻醉、解剖、采集、体外受精、培养、洗涤、装管、移植直至缝合、后期护理等所有环节都要严格执行无菌化操作，无论是对供体、受体的污染还是对精子、卵子、受精卵的污染，都会对降低胚胎质量和移植妊娠率。大量研究表明病原体污染和操作污染是造成胚胎死亡和早期妊娠中断的主要原因［16］，同时操作水平的高低会直接影响移植妊娠率，熟练的操作者手法轻柔迅捷，可大大缩短操作时间，减少对生殖系统和胚胎的不良刺激。

4.5 移植时期和移植部位 大量研究证实，2细胞期胚胎进行输卵管膨大部移植的成功率高于1细胞期胚胎的输卵管伞部移植和8细胞期的子宫移植，其原因不仅是2细胞胚胎状态比较稳定，细胞质量较好，易着床，另外还是由于输卵管伞口包裹于卵黄囊膜内，囊膜开口的位置隐蔽，剪开卵黄囊寻找伞口时会分泌许多组织液及血液，既影响视野也容易堵塞移卵管。而采用输卵管膨大部移植法降低了移植难度，克服了伞口移植的困难，易于操作，胚胎进入输卵管后顺行进入膨大部继续发育，不易漏出和逆行［17］。8细胞期胚胎由于在体外培养时间过长因而总体受孕成功率比输卵管移植较低。当然，移植的胚胎数量也不能过多，如单侧移植每次不能超过10枚，双侧移植不能超过25枚，移植太多可导致胚胎发育不均衡，造成胚胎器官和神经发育障碍同时对受体健康不利。

5 小结

胚胎移植技术作为一项新兴发展起来的生物净化手段，与传统的剖腹产和药物净化技术相比确有其优势，如净化效果明显、结果可靠，避免了剖腹产成活率低、手术时间难以掌握，病原体通过胎盘垂直传播等缺点。但目前我国胚胎移植的成功率还不是很高，大约只有40%左右，而上世纪末，国外的胚胎移植成功率已达60%以上。因此我要进一步加强胚胎移植相关技术的深入研究，如加强超数排卵技术方案的研究，提高超排效果，产生更多可用胚胎，有效解决胚胎来源问题;加强体外受精研究，改进受精卵培养和挑选方法，使用显微操作受精，提高体外受精成功率;加强胚胎移植操作方法研究，简化技术操作环节，解决输卵管出血、破漏、逆行等问题;加强胚胎分割技术、性别控制技术等研究;积极开展胚胎移植技术的培训工作，建立胚胎移植技术队伍，促进胚胎移植技术推广应用。我们相信，随着各环节工作的不断完善，胚胎移植的成功率将会迅速提高，胚胎移植生物净化将成为目前培育SPF级小鼠的首选技术。

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