芽孢杆菌在动物肠道内的作用机制及其动物生产应用

■吴逸飞 孙 宏 姚晓红 汤江武 王 新柳 永 李园成

(1.浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所，浙江杭州 310021；2.华中农业大学生命科学技术学院，湖北武汉 430010)

微生态制剂又称为益生素，是在微生态理论指导下采用有益微生物，经培养、发酵、干燥等工艺制成的生物制剂或活菌制剂，它是养殖业中抗生素有效的替代品。目前，作为微生态制剂使用的微生物主要包括乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌3类。其中芽孢杆菌作为微生态制剂，具有抗逆性好、耐高温、易储存等特点，较其它两者具有较大优势。随着2006年起欧盟国家对饲料中添加抗生素的全面禁止，微生态制剂替代抗生素的应用逐步受到国内外学者的关注；同时芽孢杆菌的生产品种和规模也日益扩大，研究确定其在动物肠道内的作用机理显得十分必要。

1 芽孢杆菌在动物肠道内的作用机理

芽孢是芽孢杆菌进入动物肠道的主要形式。芽孢能否在动物肠道中萌发、增殖是影响其饲用效果的主要因素。

1.1 芽孢杆菌对肠道不良环境的抵抗

动物的肠道内存在诸多不良的环境，如低pH值的胃酸、高浓度的胆盐、相对厌氧的环境等，这些环境不利于微生态制剂发挥作用。因此如何有效抵御这些不良环境的影响，是芽孢杆菌在动物体内发挥作用的前提。在体外试验中，Hyronimus等（2000）研究了13种芽孢杆菌对肠道模拟液的耐受情况，发现凝结芽孢杆菌（B.coagulans）的芽孢能够抵抗胆盐浓度为0.3%的模拟肠胃液。相似的研究也表明枯草芽孢杆菌（B.subtilis）的芽孢对肠道酸性环境的耐受性要明显好于其营养体（Clavel等，2004）。同时，研究表明芽孢对于胃肠道极端环境的耐受性，随着芽孢杆菌种类的不同而各不相同，特别是蜡状芽孢杆菌（B.cereus）所产芽孢的耐受性相对较差（Duc等，2004）。体内研究表明，当大鼠灌喂2×108CFU枯草芽孢后，几乎所有的芽孢均可抵御胃肠道的不利环境而在小肠中发挥作用（Duc等，2003），而采用芽孢杆菌的营养体处理，在小肠中几乎检测不到营养体细胞。对于芽孢如何能够在体内抵御各种不良环境，目前还没有定论。一种可能的原因是芽孢在经过整个动物消化道的过程中，可以耐受胃酸，从而顺利到达肠道，在消化液稀释作用的帮助下，最终在肠道得以顺利萌发（Faille，2004）。

1.2 芽孢在动物肠道中的萌发

芽孢杆菌以芽孢方式摄入体内，必然和普通乳酸菌等益生菌的作用方式有差异。国外从上世纪80年代开始对芽孢在动物肠道内的作用方式进行研究。Ozawa等（1981）通过给断奶仔猪饲喂B.subtilis后，发现消化道中其数量不断增加，在停止饲喂芽孢杆菌后一周，在猪的后肠仍能检测出104～105个/g芽孢。Klijn等（1995）以105CFU嗜热芽孢杆菌（B.stearothermophilus）芽孢喂食小鼠，8 d后粪便中仍然可持续检测到芽孢的存在。如此长的保留时间远远高于土壤微生物在肠道中的保留时间，表明芽孢在肠道中存在一定的互作机制。

另一方面，芽孢在不同试验动物肠道中的保留特性差异很大。在禽类中的定植时间要显著高于哺乳动物。如La Ragion等（2003）的研究表明，B.subtilis的芽孢能在肉鸡中持续存在36 d以上。Youngman等（1984）发现对动物投加108CFU芽孢，在摄入3 h后就可以在粪便中检测到其存在，并发现粪便中总的芽孢数量为摄入量的6倍以上。因此，该试验结果可以间接推断出芽孢在进入动物肠道后，存在一个萌发过程。随着研究的不断深入，已在越来越多种类的芽孢杆菌中发现了这种现象，包括蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌等（Jadamus，2001）。目前，最为直接的证据是采用分子生物学手段对芽孢的萌发进行研究。Casula等（2002）将枯草芽孢杆菌的ftsH基因和大肠杆菌的lacZ基因进行融合，由于ftsH基因只在芽孢杆菌的营养体阶段表达，因此这个融合基因的mRNA只在芽孢萌发时才能够被检测。通过这种分子手段，最终发现芽孢可能最早在空肠内就已萌发。

1.3 芽孢杆菌在动物肠道中抑菌作用机理

添加芽孢杆菌能够减少肠道中有害微生物的数量，同时提高肠道益生菌的数量。Han等（1984）研究发现，生长猪连续饲喂5周含有丁酸梭菌的饲料，排出的粪便中肠球菌和肠杆菌的数量显著降低，而丁酸梭菌和乳酸杆菌的数量则显著增加。关于芽孢杆菌的抑菌机理，目前主要有生物夺氧、菌群调整、生物拮抗、提高免疫功能和增强酶活性，防止动物肠道病原菌等多种说法。

芽孢杆菌为需氧菌，在生长过程中需要消耗大量的氧气，该环境有利于乳酸菌、双歧杆菌等厌氧菌的生长，抑制需氧肠杆菌的繁殖，从而减少消化道疾病的发生。Maruta等（1996）采用饲喂生猪含有107CFU/g B.subtilis的日粮3周后发现，粪便中的厌氧菌如双歧杆菌和乳酸杆菌数量显著上升，而需氧菌如肠杆菌的数量显著下降，其它病原菌如链球菌和产气荚膜梭菌的数量也显著下降。

芽孢杆菌还能够产生某些抑菌物质，对一些病原菌起拮抗作用，进而调整肠道微生态平衡。Teo等（2005）从鸡肠道中分离得到一株B.subtilis PB6，发现其对产气荚膜梭菌有明显的拮抗作用，随后他们又从PB6的培养物中分离得到大小约为960 Da到983 Da不等的拮抗因子，发现该拮抗因子对艰难梭菌、肺炎链球菌、空肠弯曲菌和弯曲菌的生长均有抑制作用。

芽孢杆菌的摄入能够刺激动物免疫系统，使淋巴组织处于高度反应状态。Scharek（2007）饲喂生猪B.subtilis，发现其可显著提高CD8+T淋巴细胞的数量。Duc（2004）的研究发现摄入机体内的芽孢能够分散在肠道淋巴组织周围，推测芽孢杆菌可能的作用部位是肠道内的淋巴系统。也有研究发现芽孢能够刺激动物机体的B淋巴细胞群，产生IgG、IgA等抗体，进而发生一系列免疫应答反应（Guidi-Rontani，1999）。国内潘康成等（2005）的研究表明，芽孢的摄入能够诱导B淋巴细胞和巨噬细胞产生特定的细胞因子。

2 芽孢杆菌在养殖业中的应用

2.1 芽孢杆菌在畜牧养殖业中的应用

芽孢杆菌能够耐受动物胃液，在动物肠道中生长萌发，且分泌多种酶类，促进动物体消化吸收，同时在肠道内竞争性夺氧，形成厌氧环境，减少有害微生物含量，促进益生菌生长，从而改善动物肠道环境。国外La Ragione等（2003）在对禽类喂食一定量的枯草芽孢后发现，芽孢能够有效的抑制致病菌大肠杆菌O78：K80和沙门氏菌，并且促进肠道内乳杆菌等益生菌的生长。Wang等（2009）利用复合芽孢杆菌制剂（包含枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌）分别以0.05%、0.1%和0.2%添加量添加到基础日粮中饲喂生长猪35 d后，发现随着芽孢添加量的提高，猪的日增重也逐渐提高，试验组的日均采食量显著高于对照组，但对料重比、干物质和氮消化利用率均没有显著影响。添加蜡状芽孢杆菌能够提高猪的料肉比，且对预防猪肠道疾病有较好的帮助（Kyriakis等，1999）。Kritas等（2006）研究了芽孢杆菌制剂对羔羊死亡率和绵羊产奶量的影响，发现添加芽孢杆菌能够降低羔羊死亡率。陈家祥等（2010）以地衣芽孢杆菌饲喂麻羽肉鸡发现，添加不同水平的地衣芽孢杆菌和抗生素都有增高肉鸡肠绒毛高度、降低隐窝深度和增加肠黏膜厚度的作用。

2.2 芽孢杆菌在水产养殖业中的应用

芽孢杆菌在水产养殖上的应用要广于动物养殖，特别是枯草芽孢杆菌对虾的肠道致病菌有明显的改良作用。这主要是因为芽孢杆菌可以产生多种酶类，降解水体中的多种有机物，直接利用水体中的硝酸盐和亚硝酸盐，从而对水体中的多种病原菌起到拮抗作用，改善养殖水体水质（Urdaci和Pinchuk，2004）。Saeed等（2006）通过向水体中泼洒芽孢杆菌制剂，发现对虾肠道中的芽孢杆菌数明显提高，而其它细菌无明显变化；肠道中的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶显著高于对照组，存活率比对照组显著提高。Vaseeharan等（2003）研究认为，枯草芽孢杆菌对斑节对虾黑鳃病的病原菌哈氏弧菌的生长有抑制作用，长期使用将使对虾的累积致死率比对照组减少90%。另外芽孢杆菌还能显著促进养殖动物的消化吸收，提高营养物质在肠道内的消化利用率。

3 研究与应用展望

研究已表明芽孢杆菌可耐受动物肠道的恶劣环境，萌发成营养体最终刺激肠道免疫系统发挥其作用。尽管如此，目前还存在很多问题尚未解决，①在不同的养殖动物中，由于芽孢的萌发时间和萌发位置不同，具体的使用剂量有待进一步研究完善(特别是芽孢在瘤胃动物中的作用机制和体内试验很少)；②芽孢杆菌产品质量指标、检测方法等行业标准尚未建立；③芽孢杆菌如何影响养殖动物消化器官发育，刺激动物体机体免疫能力；④芽孢与肠道菌群互作效应未知等。当前，抗生素滥用、食品安全和环境保护等问题已经成为各国养殖业发展中考虑的重点，因此，芽孢杆菌类微生态制剂必将具有更广阔的开发价值和应用前景。

（参考文献25篇，刊略，需者可函索）