水通道蛋白5与肾脏疾病

水通道蛋白(AQP)泛指一组分子量不超过30 kD的跨膜内在蛋白家族，由水通道蛋白、水甘油通道蛋白、超级水通道蛋白三个亚科组成。在哺乳动物中，主要表现为13个亚型(AQP 0～12)。其中仅对水分子有通透性的包括AQP0、AQP1、AQP2、AQP4、AQP5、AQP6和AQP8；不仅对水分子有通透性，对甘油亦具通透性[1]的包括AQP3、AQP7、AQP9和AQP10。目前AQP已被证实存在于机体多种组织器官及腺体腺泡细胞表面，并在维持体内的水平衡和水转运中扮演着重要角色[2]。AQP家族AQP序列中有两个高度保守的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(NPA)序列,是该蛋白家族成员共有的特征序列,目前其生物学意义并不清楚。另有报道，AQP家族还存在一个有着高度NPA序列变异的亚科，即超级水通道蛋白AQP11及AQP12，他们不表达于细胞膜上，提示NPA序列可能参与了AQP蛋白在细胞膜上的定位[3,4]。

近年来AQP在某些疾病中的意义，引起了广泛的关注。如目前已发现的AQP 0～12中，至少8种亚型在肾脏有表达并参与尿液的浓缩稀释功能[5]。既往文献多认为，AQP5主要存在于分泌腺体组织中(如唾液腺、泪腺，眼、耳)，其异常表达与这些部位的相关疾病有密切的联系[1,6-8]。近年来有研究发现，在负责肾小管碳酸氢盐分泌的肾集合管B型闰细胞上也有AQP5表达，Procino等[9]对人类来源的多能干细胞及小鼠、大鼠、人类肾脏进行RT-PCR、Western Blot及免疫细胞化学检测,在集合管系统的B型闰细胞上发现了AQP5的转录与表达，据此推测AQP5可能通过调节该细胞的体积影响尿液的浓缩稀释功能。随后， Wu等[10]用免疫荧光法对15例正常人及17例糖尿病肾病患者的肾活检进行了AQP5表达的分析发现，实验组中含有AQP5分子的肾小管细胞比例明显高于对照组，故认为其有可能参与了糖尿病肾病的发生发展过程。本文就AQP5的生物学特性及其在相关疾病中的病理生理学意义作一综述。

AQP5的起源、结构、生物学特性及调控

1995年，Raina等[11]为了研究唾液腺及泪腺的分泌机制，利用同源基因克隆策略，从大鼠颌下腺组织中发现了一个新的AQP基因，其cDNA与AQP1有45%相似性，其翻译后的蛋白质有六个跨膜区，其B、D、E环与其他AQP有着高度的同源性，并将其命名为AQP5。1996年，Ishida等[12]在人泪腺中再次证实了AQP5的存在。随后，陆续在眼睛、唾液腺、泪腺、肺脏、气道及耳蜗等组织也发现了AQP5。

AQP5分子由6个跨膜α-螺旋和5 个连接跨膜区的环(A-E 环)组成，其中B、D 环及羧基、氨基末端均位于胞内区,A、C、E 环定位于胞外区。D环上有环腺苷酸(cAMP)蛋白激酶磷酸化结合位点；B、E环具显著疏水性，且含有NPA序列。AQP5 B环和E环正好在NPA 处向细胞膜内凹陷折叠，并且分别与邻近跨膜区形成半个孔道，彼此对称分布，由此构成一条狭窄的分子通道，使得整个AQP5蛋白呈沙漏样结构镶嵌在细胞膜上[13-15]。生理状况下，AQP5分子储存于细胞内的囊泡中，在受到体内、体外因素的刺激时，胞内囊泡向顶端细胞膜移动并发生融合，出现AQP5的重新分布。但这种移位非常短暂迅速，刺激结束后5 min内AQP5将重新趋于内在化[6,16]。

AQP5广泛存在于多种组织和腺体细胞膜上，而且在分泌性的组织或腺体中的表达显著高于非分泌性细胞或组织，且大多数AQP5都分布于分泌细胞的顶膜上。相反在分泌腺的叶间组织及以吸收功能为主的纤毛细胞、肠腺细胞和杯状细胞或分泌细胞的基膜上则没有或少有AQP5表达[16]。

AQP5的转运物为水，对尿酸及葡萄糖等小分子物质不具通透性[17]。目前对AQP5生理功能的研究并不够深入，多数研究认为其主要参与机体外分泌腺的分泌过程，且在调控体液平衡和腺体分泌中起重要作用[6,8,18]。

AQP5在细胞膜上的表达受许多外界刺激的调控。Ishikawa等[19]为了研究唾液腺分泌过程，对大鼠腮腺组织进行了免疫印迹分析，显示在胆碱类药物的刺激下，AQP5能迅速从细胞内质膜转运至细胞顶端膜，而抑制毒蕈碱样胆碱能受体(M3受体)将影响这一转移过程。于是，他们认为正是乙酰胆碱与M3受体的结合导致了AQP5在细胞内质膜及顶端膜发生移位。该论点亦得到了其他学者的证实，Tsubota 等[7]对干燥综合征患者泪腺的活检组织进行研究发现，与对照组相比，实验组中的AQP5分子离散于细胞质中，细胞膜上鲜有表达。Li等[20]提取了11例干燥综合症患者血清中的自身抗体IgG，并通过RT-PCR及免疫组化、Western Blot等多种方法证实了该抗体对M3受体有拮抗作用。随后，该作者又以大鼠的腮腺细胞为对象，研究该抗体对分泌细胞上AQP5表达的影响，将匹鲁卡品预处理过的细胞置于加有该抗体的培养基中培育12h发现，腺泡细胞表面的AQP5显著减少。由此推测可能是这种自身抗体介导的抑制作用阻碍了AQP5的重新定位及再分布，从而导致跨上皮的水分泌减少，表现为无泪、口干。此外，Sidhaye等[18]发现在低渗环境下，小鼠肺上皮细胞膜上的AQP5表达减少，但AQP5蛋白分子的合成并不受影响，提示体内渗透压可能也是影响AQP5定位及生理功能的因素之一。Yang等[21]研究还发现，cAMP对AQP5转录及其向细胞膜的转运起着重要调控作用。此外，Kumari等[1]发现，蛋白激酶A(PKA)的激活可导致AQP5发生细胞内在化， 因为离体Wistar小鼠角膜细胞在PKA激动剂mp-cAMP作用下，30 min后细胞膜AQP5显著下调；反之，PKA拮抗剂可使AQP5的膜表达明显上升。Sidhaye 等[18]观察了不同时相cAMP对AQP5表达的双向调节作用，发现小鼠肺上皮细胞短时间暴露于cAMP时，AQP5蛋白呈现细胞内在化、溶酶体降解增加及随之出现的AQP5膜表达显著下调；而长时间的cAMP暴露，却表现为AQP5 蛋白总量增加及膜表达上升。在Wang和Zheng[22]以大鼠鼻腔上皮细胞为研究对象的实验中，PKA抑制剂H89能下调AQP5的表达，而予cAMP诱导剂则可增加细胞上AQP5的表达，促进液体的分泌。以上不同的研究现象提示，虽然PKA通路参与了AQP5表达的调控，但在不同的组织中，其调控方向与组织或器官的功能相关。

AQP5与疾病的关系

单器官疾病

角膜疾病 角膜上皮层与角膜的保护和润滑息息相关，故其功能失调可能导致角膜水肿或干眼症[23,24]。Kumari等[1]对小鼠角膜的AQP5表达进行免疫定位发现，在角膜最外层的多层上皮细胞，基底部的单层柱状上皮均有丰富的AQP5表达。Thiagarajah等[25]对AQP5基因敲除小鼠的研究发现，敲除AQP5的转基因小鼠角膜上皮细胞的水通透率不到正常组的一半，形态学检查亦显示角膜显著变厚。提示在角膜上皮细胞及基质细胞中，AQP5可能起到防止角膜脱水、促进修复及保持角膜透明度的作用。

梅尼埃病 梅尼埃病是慢性内耳疾病，其内耳改变主要为内淋巴的积水，这一改变是内淋巴液的高分泌和低吸收所致。Mhatre等[26]在对啮齿类动物及人内耳组织的研究中发现，AQP5位于内耳蜗管的外沟细胞上，该细胞参与构成了内耳外淋巴-内淋巴屏障。在亚细胞水平，AQP5位于靠近外沟细胞顶端膜的胞内囊泡内，与AQP4共同构成了外淋巴-内淋巴屏障上水转运的分子基础。Hirt等[27]探讨大鼠及人类耳蜗组织AQP5表达，并在梅尼埃病的大鼠模型中对AQP5的定位及功能进行研究发现，其耳蜗组织AQP5表达增加，故认为由AQP5介导的外淋巴-内淋巴水通道可能是导致内淋巴高分泌的原因之一。

哮喘 支气管哮喘是由多种细胞和细胞组分参与的气道高反应性慢性炎症，其病因并不十分清楚。在人类及小鼠的肺组织中，AQP5表达于支气管纤维柱状上皮细胞、Ⅰ型及Ⅱ型肺泡细胞[28]。与AQP1 共同构成了气道、肺间质及毛细血管之间渗透性水转运的主要路径[29]。Krane等[28]对野生型小鼠及AQP5基因缺失的小鼠予以胆碱类药物发现，与野生型小鼠相比，AQP5缺失小鼠气道收缩反应更为强烈，气道阻力明显增加；AQP5 位于哮喘易感气道高反应的基因区,故作者认为AQP5可能也是引起气道高反应的目标基因之一。Dong等[30]亦报道，在卵清白蛋白介导的哮喘小鼠模型肺组织中，可见肺泡上皮细胞AQP1和AQP5 mRNA的数量明显减少；而平喘药可通过上调肺泡细胞AQP1及AQP5水平缓解哮喘小鼠肺水肿，其机制可能是上调的AQP1及AQP5有助于肺泡内水肿液的清除。

全身性疾病

干燥综合征 干燥综合征是一种以侵犯泪腺、唾液腺等外分泌腺体，具有高度淋巴细胞浸润为特征的弥漫性结缔组织病，主要累及由柱状上皮细胞构成的外分泌腺体。以唾液腺和泪腺的病变为代表，病理表现腺体上皮细胞的萎缩破坏，功能受到严重损害。但对干燥综合征活检组织的观察及研究中发现，除了淋巴浸润及腺体破坏外，有些组织区域并未遭到严重损害，表明该病发生原因的多元性[7]。Steinfeld等[31]对正常人及干燥综合征患者的唾液腺活检进行了研究发现，观察组唾液腺分泌细胞膜上AQP5表达较正常组明显减少。Tsubota等[7]比较了正常人与干燥综合征患者泪腺的活检组织，与Steinfeld等[31]的研究结果一致，干燥综合征患者的泪腺分泌细胞顶端膜上AQP5的表达亦明显减少。而研究已证实AQP5在细胞膜上的定位障碍能导致腺体分泌功能受损，故检测到AQP5的减少为干燥综合症的发生提供了合理的解释[6]。Tsubota等[7]进一步研究显示，干燥综合征患者细胞基膜上的Na+-K+-ATP酶及顶端膜上的钠通道并未减少，AQP5的总量亦未减少，故推测干燥综合症中AQP5的表达异常是由其在细胞内的转运障碍导致的。另有学者对一组较大样本的干燥综合征患者唾液腺活检研究中则未发现其AQP5表达与正常组有不同，该结果提示干燥综合症还存在其他发病机制[32]。

高血压病 Lifton等[33]利用连锁分析及定位克隆技术，确定了20种与人类原发性高血压相关的基因，其中大部分基因编码的蛋白质均参与组成或调控了肾脏对离子的转运、离子通道、转运体及转运通路的形成。Meneton等[34]一项以小鼠为对象进行的基因靶向实验发现，高血压疾病中发生单基因突变的大部分是编码肾远曲小管离子转运通道蛋白或其调控蛋白的基因，在遗传学上确立了肾脏在高血压疾病发病机制中的作用。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的激活在高血压的发生发展过程中起到重要作用，而肾素是由肾脏的近球细胞合成、存储和释放。Adamzik等[35]对人类AQP5启动子进行测序，发现在-1364位点有一个A/C的基因多态性。当C取代A时能引起AQP5转录水平下降。随后作者将103例年轻、健康，同时予高盐饮食的志愿者及96例患有冠心病的老年患者分别分为AC/CC基因型组及AC/CC基因型组，对AQP5基因型与RAAS的关系进行了研究发现，无论正常人或是病患，AA基因型者血清血管紧张素Ⅱ及醛固酮含量均高于AC/CC基因型者，提示与C等位基因相关的AQP5的减少能够抑制RAAS的激活。故推测AQP5启动子的单核苷酸多态性可能改变AQP5在离体细胞及组织的表达，并影响RAAS对血压的调控。此外，基于Procino等[9]对肾脏中AQP5的研究结果，即AQP5表达于肾脏集合管B型闰细胞的顶端膜上，而闰细胞基膜上无相应的水通道蛋白表达， Hadchouel等[36]提出AQP5可能通过改变B型闰细胞的体积来控制ATP的释放，进而与pendrin蛋白一同参与血压的调控。pendrin蛋白的激活可造成细胞内短暂的高渗环境，使水分子通过AQP5内流进入细胞，导致细胞体积增大而刺激ATP的释放，ATP与肾脏连接小管或集合管上的嘌呤受体P2Y2结合后能降低上皮细胞钠通道的活性，从而减少水钠潴留。而这条通路受阻可能参与了原发性高血压的发病过程[37]。

肾脏疾病

AQP5在肾脏的分布及表达 Procino等[9]在肾脏来源的多能干细胞(ARPC)上进行了13种AQP亚型表达的检测，发现ARPC有AQP5 mRNA的转录及成熟的AQP5蛋白的表达。在接下来的体内实验中进一步发现，AQP5蛋白在人、大鼠、小鼠的肾小管B型闰细胞顶膜上均有表达。免疫组化显示AQP5存在于集合管系统的B型闰细胞顶膜上，并且与阴离子交换蛋白pendrin共存。值得注意的是，AQP5与pendrin的共表达是多种上皮细胞的一个共同特点，如耳蜗细胞、支气管上皮细胞等[25,38,39]。Hadchouel等[36]研究显示，在缺K+状态下，pendrin从细胞膜转移到了胞质，令人感兴趣的是，对肾脏AQP5的免疫荧光分析显示，在缺K+的动物中，AQP5亦从细胞膜转移到了细胞质中，这些现象不仅进一步说明AQP5存在于B型闰细胞上，还提示pendrin 和AQP5可能受同一调节机制的调控。但以往也有作者对此持不同观点，Funaki等[40]在大鼠的不同组织中进行了AQP5转录水平的研究，在肾脏中未发现AQP5 mRNA。同样，Krane等[41]对小鼠的不同组织分别进行Nortern Blot和Western Blot的分析也发现，AQP5仅存在于肺脏、唾液腺及泪腺，而在肾脏并未发现其存在。这些有争议的研究结果均代表不同角度、不同层面的AQP5研究内容。

肾脏AQP5的生理功能 目前AQP5在肾脏的功能尚不明确，之前有文献报道过在低渗环境中，AQP5与TRPV4共同参与了唾液腺细胞的调节性细胞容积减小[42]。Thiagarajah等[25]亦曾报道缺乏AQP5的小鼠的角膜较野生型小鼠明显增厚，并认为这是因为AQP5缺失小鼠的角膜上皮细胞丧失了在浓度变化时调节细胞体积的能力。同样的，在Procino等[9]的研究中提到，肾脏B型闰细胞的基膜没有AQP的表达，故其推测AQP5可能并不参与远曲小管的水重吸收过程，而只是起到一个渗透压感受器的作用，即在髓袢升支粗段产生的低渗液体中调节连接小管及集合管上B型闰细胞的体积，从而与pendrin蛋白一同起到调节体内水平衡的作用。

AQP5与糖尿病肾病 肾脏作为机体主要的排泄器官，通过尿液的生成与排出调节体内水和电解质平衡，调节体液渗透压、体液量和电解质浓度。临床上肾脏功能失调引起的诸多症状(如水肿、高血压、心力衰竭、少尿及无尿等)，均与水代谢失衡密不可分。作为水通道蛋白亚型含量最多的器官，肾脏是AQP的研究热点。如在血糖控制不佳的糖尿病肾病中，多尿是除尿糖以外的另一个与肾脏损伤相关的早期临床表现[43]。而随着人们对AQP研究的深入，目前认为渗透性利尿并不是多尿发生的唯一机制[44、45]。病理情况下(如肾炎、低血钾等)可引起AQP2总量或顶膜表达减少，从而导致多尿[46]。另有研究发现编码组蛋白甲基化转移酶的Dot1l缺失时，小鼠可出现不明原因的多尿[47]。随后，Wu等[10]研究了Dot1l缺失与多尿发生机制的关系发现，AQP5能影响AQP2在细胞膜上的表达，推测Dot1l基因缺失小鼠(Dot1lAC小鼠)或糖尿病肾病患者的多尿症状可能与AQP5的上调有关。为了进一步证实该推测，该作者采用Dot1lAC作为糖尿病肾病的模型，通过PCR和DNA序列分析发现，与正常对照相比，Dot1lAC的AQP5是上调最明显的基因，微阵列芯片分析结果也显示，Dot1lAC 小鼠的AQP5 mRNA 水平较正常小鼠上升了26倍，RT-qPCR法检测表明两组甚至有105倍的差异。同样，在Dot1lAC小鼠的肾脏细胞中，AQP5蛋白则有明显的表达，而在对照组中，几乎检测不到AQP5蛋白的含量。在随后的体内外实验中,该作者再次证实了Dot1a能抑制AQP5的表达，而AQP5 与AQP2的相互作用能降低AQP2在细胞膜上的表达。用免疫荧光法对15例正常人及17例糖尿病肾病患者的肾活检进行了AQP5及AQP2表达的对比分析。对照组未检测到AQP5 的表达，而AQP2 则主要存在于细胞的顶膜上。在所观察的糖尿病肾病的活检组织中均发现上述两种蛋白质的存在，研究者对仅表达AQP2或AQP5，或两者均表达的小管进行了计数，发现在17个肾活检病例的587个肾小管中，79.6%的小管上皮细胞同时表达AQP2及AQP5,这两种蛋白呈离散状态存在于肾小管主细胞核周区域。故作者推测在病理情况下，AQP5 表达在肾脏小管上皮的主细胞上，且能够通过在细胞核周捕获AQP2来阻止其在细胞膜上的表达，从而影响水的重吸收，导致多尿。利用Aqp5基因敲除或Aqp5与Dot11双基因敲除鼠，以及这些鼠的糖尿病模型，可能为揭示Aqp5在糖尿病肾病中的作用提供帮助。

展 望

AQP5的作用及其调节出现在了多种常见的全身性疾病的发病机制中。随着人们对AQP的认识加深，其在水电解质平衡紊乱或水分布异常疾病发病机制中的作用日趋重要。由于肾脏疾病及糖尿病肾病、肾性高血压等相关疾病在人群中的发病率高、影响面广，寻找这些疾病的早期诊断指标及早期干预手段显得尤为重要和紧迫。通过对AQP5的生理功能及病理生理作用的探讨，或许在不久的将来，AQP5可望成为治疗水代谢紊乱相关疾病的靶基因。其表达产物是否可作为优于微量白蛋白的糖尿病肾病早期诊断指标是一个值得探讨的研究方向。此外，诸多慢性肾脏病，如IgA肾病的发生及发展过程中均可出现夜尿增多或多尿的临床表现，AQP5在这些疾病中的病理生理学意义亦是令人感兴趣的课题。 因此，对AQP5在水代谢紊乱性疾病中的发病及调节机制的深入研究可望为上述疾病的早期诊断和干预治疗提供新的思路与方法。

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