抗血小板聚集药物作用机制的研究进展

中国人民解放军后勤学院门诊部（100858）李敏

血小板的聚集（platelet aggregation）是指血小板与血小板之间的相互粘着，这一过程需要纤维蛋白原、Ca2+及血小板膜上的GPIIb/IIIa的参与。在未受刺激的静息血小板膜上的GPIIb/IIIa并不能与纤维蛋白原结合。在致聚剂的激活下，GPIIb/IIIa分子上的纤维蛋白原受体暴露，在Ca2+的作用下纤维蛋白原可与之结合，从而连接相邻的血小板，充当聚集的桥梁，使血小板聚集成团。

血小板聚集反应的形式可因致聚剂的种类及浓度的不同而有差异。如低浓度ADP引起的血小板聚集只出现在第一聚集时相，并很快解聚；中等浓度ADP引起的聚集，在第一时相结束和解聚后不久，又出现不可逆的第二聚集时相，第二聚集时相的出现是由于血小板释放内源性ADP所致；高浓度ADP引起的聚集，由于第一聚集时相和第二聚集时相相继发生，只出现单一的不可逆性聚集。凝血酶所引起的血小板聚集反应与ADP相似，也呈剂量依赖方式，引起单相或双向血小板聚集。胶原只引起血小板单相的不可逆聚集，聚集反应与释放反应同时发生，故胶原所诱发的血小板单相聚集与内源性ADP的释放和TXA2的形成有关[1]。

目前，从血小板发生聚集作用的机制来看，抗血小板聚集药物主要有：①抑制血栓烷A2（thromboxane A2，TXA2）诱导的血小板聚集，以阿司匹林（aspirin）为代表；②抑制二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）诱导的血小板聚集，以噻氯匹啶（tic1opidine）、氯吡格雷（clopidogrel）为代表；③血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗药，抑制血小板聚集的最终共同途径，代表药物为阿昔单抗（abciximab）、替罗非班（tirofiban）、依替巴肽（eptifibatide）。此外，血小板激活因子（PAF）受体拮抗剂、凝血酶和凝血因子Xa（FXa）抑制剂、钙离子（Ca2+）通道拮抗剂、5-HT2受体拮抗剂等均有抑制血小板聚集作用，本文依次仅从以上3个方面对抗血小板药物进行综述，并简述一些重要的抗血小板活性。

1 血栓烷A2（TXA2）抑制剂

1.1 阿司匹林（ASA） 阿司匹林是最早被应用于抗栓治疗的抗血小板药物，主要用于无ASA过敏或未接受溶栓、抗凝治疗的心、脑血管动脉血栓疾病的一、二级预防。ASA的一级预防疗效由迄今最大的一项Meta分析再次予以肯定[2]，ASA已经被确立为治疗急性心肌梗死（AMI）、不稳定心绞痛及心肌梗死（MI）二级预防的经典用药。ASA在体内具有抗血栓的特性，能明显减少周围动脉内阻塞性血栓的形成。

1971年，Vane阐明了低浓度阿司匹林的主要作用机制是不可逆阻断乙酰化环氧酶（COX2）活性部分，从而阻断TXA2生成的作用，而后者是血小板聚集的一个强力促进因素。高浓度阿司匹林能直接抑制血管壁中合成酶，减少前列环素的合成，不利于对TXA2作用的对抗和平衡，而且发生明显的胃肠道不良反应。因此，使用阿司匹林应选择合适的剂量，阿司匹林经肠胃吸收后30～40min可达峰值，当给予低于160mg的口服剂量在30min可最大程度抑制血小板功能，大多数人每天只要服用80～100mg的阿司匹林，即可较好地防止动脉血栓形成。在我国，阿司匹林用于脑卒中二级预防推荐剂量为50～100mg/d[3]，而用于预防急性心肌梗死或冠心病介入治疗手术后，应每日1次口服300mg[4]。

1.2 鱼油制剂 花生四烯酸（AA）是膜磷脂的正常组成部分，为血栓烷（TXA2）生物合成的前体，经环氧化酶途径生成不稳定的环内过氧化物，再经血小板内血栓烷合成酶作用生成TXA2。鱼油制剂的主要成分是二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）。动物实验表明，于动脉腔内成形术前3周开始应用鱼油制剂可降低动脉腔内成形术时及术后血小板的黏附功能，增加血小板膜的流动性，这有助于减轻手术局部血小板与血管壁的相互作用，防止早期血栓形成及晚期中膜平滑肌细胞的增殖。

2 磷酸二酯酶（ADP）抑制剂

血小板内的ATP在腺苷酸环化酶的催化下生成cAMP，cAMP在磷酸二酯酶的作用下代谢成5′-2AMP，cAMP通过cAMP依赖蛋白激酶调节血小板功能。血小板聚集本质上是一个Ca2+的纤维蛋白原桥连过程，血小板聚集功能受到血小板内的cAMP含量调节，当cAMP含量增加，可以激活蛋白激酶，使蛋白磷酸化，兴奋钙泵并抑制Ca2+从储库中释放，从而抑制血小板的聚集；因此腺苷酸环化酶激活剂和血小板磷酸二酯酶抑制剂均可增加血小板内cAMP含量，抑制血小板聚集[5]。

2.1 磷酸二酯酶抑制剂

2.1.1 双嘧达莫（dipyridamole） 又名潘生丁（persantin），1960年始用于临床作为血管舒张剂，随后体外实验发现双嘧达莫可以抑制心血管患者血小板聚集，对血小板有抑制作用，因此逐渐被应用作为抗血小板药物。其主要的作用机制是抑制磷酸二酯酶，使cAMP增高，也能抑制红细胞和血管内皮对腺苷的摄取和代谢，进而激活血小板腺苷环化酶使cAMP浓度增高，还可以刺激前列腺素的释放以及抑制TXA2的形成。该类药物的缺点是化学稳定性差，半衰期短，必须加倍剂量或者使用缓释剂才能在24h内起到抑制血小板功能的作用。临床应用发现其在抗冠状动脉血栓形成、脑卒中复发方面有重要作用。在经皮冠状动脉介入治疗术后患者的抗血小板治疗中，联合应用双嘧达莫和氯吡格雷，可降低近期死亡率且不增加脑出血等副作用。

2.1.2 西洛他唑[6]西洛他唑是喹啉类衍生物，通过抑制细胞的磷酸二酯酶（特别是对PDEⅢ的抑制）来治疗间歇性跛行。西洛他唑及其代谢产物是cAMP2PDEⅢ抑制剂，抑制活性和阻碍cAMP降解（和转化）导致cAMP在血小板和血管内上升，抑制了血小板聚集和使血小板扩张，防止血栓形成和血管阻塞，从而达到治疗目的。西洛他唑在治疗老年血栓性疾病患者血小板聚集上优于噻氯匹啶并且副作用小，治疗糖尿病下肢血管病变的疼痛和间性跛行症状疗效明显优于双嘧达莫。

2.2 ADP受体拮抗剂 ADP是第一个被发现可以促进血小板聚集的分子[7]，它存在于血小板致密颗粒上，在血小板激活时被释放并进一步激活周围循环中的血小板加速聚集[8]，是血小板聚集的重要活性因子之一。ADP在血小板质膜上存在3种受体：P2Y1、P2Y12和P2X1。

P2X1是钙离子通道受体[9]，研究表明，P2X1受体对血小板聚集作用很小。P2Y1和P2Y12则是两种不同的G蛋白偶联受体。P2Y1受体与G蛋白偶联，激活后诱导血小板变形和快速、可逆性聚集[10]。

2.2.1 噻氯吡啶 噻氯吡啶是一强效的血小板抑制剂，主要通过与ADP受体P2Y12发生不可逆结合而竞争性抑制ADP所诱导的血小板聚集，还可以抑制由花生四烯酸（AA）、胶原、血小板活化因子（PAF）等所引起的血小板聚集和释放，其最终作用是干扰血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体与纤维蛋白原结合，从而抑制血小板的激活。噻氯吡啶口服吸收良好，24～48h发挥作用，3～5d达高峰，t1/2为24～33h。用于预防急性心肌再梗死、一过性脑缺血及中风、治疗间歇性跛行等[11]。

2.2.2 氯吡格雷 氯吡格雷是第二代ADP受体拮抗剂，是一种无活性的药物前体，进入体内经肝脏细胞色素P450混合功能氧化酶（CYP450酶）系（主要是CYP3A4、CYP3A5）氧化成为有活性的代谢产物，该活性产物有一个活化巯基基团，可与P2Y12（ADP的受体）的半胱氨酸残基形成二硫键，不可逆地阻断ADP与其受体的结合，进而阻断ADP激活血小板聚集的整个过程，抑制血小板聚集[12]。每日1次口服75mg，在肠道迅速吸收，从第1d开始明显抑制ADP诱导的血小板聚集，抑制作用逐渐增强并在3～7d达到稳态。一般中止治疗5d内血小板聚集和出血时间逐渐回到基线水平。

3 糖蛋白Ⅱb/Ⅲa（GPⅡb/Ⅲa）受体拮抗剂

血小板GPⅡb/Ⅲa是一种膜结合蛋白，在静息血小板表面约有8万个分子。它是纤维蛋白原受体，由α和β两个亚单位组成的异二聚体，每个亚单位都有胞外区、跨膜区和胞内区。在激活剂作用下，血小板活化并导致GPⅡb/Ⅲa受体的空间构象发生变化，以便与纤维蛋白原或Von Wllebrand因子等结合，从而诱导血小板发生聚集。血小板GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂结合到受体上，使其不能与黏附蛋白结合，从而抑制了血小板的聚集，但并不消除血小板的黏附和分泌等重要功能。

由于GPⅡb/Ⅲa与纤维蛋白原的结合是血小板聚集的终末共同途径，因而血小板GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂可有效地预防血小板介导的血栓形成。目前，已获美国FDA批准的主要有3种经静脉的血小板GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂，即阿昔单抗、依替巴肽和替罗非班。

GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂的化学类型不尽相同，在抗血小板效力上也存在差异，这也许就是它们在减少患者血栓缺血事件上疗效不同的原因之一[13]。阿昔单抗是血小板GPⅡb/Ⅲa受体的人与鼠嵌合单克隆抗体（C7E3），可以与GPⅡb/Ⅲa受体非特异性结合，使纤维蛋白原不能与GPⅡb/Ⅲa结合，从而发挥抑制血小板聚集的作用。依替巴肽是肽类GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂，通过与血小板膜上GPⅡb/Ⅲa受体结合，占据其结合位点，使血小板膜上GPⅡb/Ⅲa受体与纤维蛋白原不能结合而抑制血小板的聚集。依替巴肽对血小板糖蛋白上Ⅱb/Ⅲa受体的抑制作用是竞争性抑制，浓度越高时抑制作用越强。依替巴肽与Ⅱb/Ⅲa受体的结合是可逆性的，停药后4h依替巴肽的作用减弱一半。替罗非班（tirofiban）是非肽类GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂，不具有抗原性，可以与GPⅡb/Ⅲa受体可逆性结合，选择性抑制GPⅡb/Ⅲa，进一步阻断纤维蛋白原与GPⅡb/Ⅲa结合，抑制血小板聚集。

4 通过酶切血小板膜糖蛋白GPIb

从中华眼镜蛇毒中分离纯化出一个新的金属蛋白酶atrase A，Atrase对ristocetin和thrombin诱导的血小板聚集有明显的抑制作用，这种抑制作用可能是与血小板膜糖蛋白GPIb和vWF关系密切，Western blot结果也证实了atrase A能特异性酶切血小板膜糖蛋白GPIb，而对vWF没有表现出裂解作用。在实验中笔者还发现，atrase A对ristocetin诱导的人PRP血小板聚集有明显的抑制作用，但对兔PRP诱导的血小板聚集的抑制作用则不明显，且ristocetin诱导兔血小板的聚集率明显低于其他5种诱导剂。Atrase A对thrombin诱导的兔血小板聚集有明显的抑制作用，对人PRP的抑制作用不明显，造成这些差别的原因和机制尚不清楚，可能与实验材料的种属差异性有关，有待于进一步深入研究。

实验结果还显示，与血小板预孵5min时，atraseA对ADP、PAF、AA、collagen引起的血小板聚集有微弱的抑制作用。随着预孵时间延长至30min，atrase A对ADP、PAF、AA、collagen引起的血小板聚集有明显的抑制作用。由于上述4种诱导剂引起血小板聚集的机制不一样，并有文献报道[14]蛇毒金属蛋白酶抑制上述4种诱导剂引起血小板聚集的机制也不相同，而已分离纯化出的atrase A是多结构域的金属蛋白酶，它抑制上述4种诱导剂引起血小板聚集的结构基础可能与其金属蛋白酶活性结构域有关，也可能与其去整合素和类去整合素样结构以及富含半胱氨酸结构有密切关系，因此它抑制4种诱导剂引起血小板聚集的具体作用机制还有待于进一步研究。

血小板的主要生理功能是参与止血与血栓形成，并且在动脉粥样硬化、肿瘤转移和炎症反应等病理损伤过程中起着重要的作用。由于蛇毒中的一些金属蛋白酶能广泛影响血液凝固、血小板聚集以及血栓的形成，因此充分利用蛇毒资源开发抗血栓药已经成为研究的热点。本实验发现，从中华眼镜蛇毒中分离纯化出的金属蛋白酶atrase A，通过特异性酶切血小板膜糖蛋白GPIb从而抑制ristocetin和thrombin诱导的血小板聚集，并对ADP、PAF、AA、collagen诱导的血小板聚集的抑制作用具有明显的时间依赖性。Atrase A是否在体内具有抗凝活性以及能否作为一种潜在的抗血栓药物尚需要进一步的研究和评价。

5 细胞质钙活化抑制剂和MAPK蛋白磷酸化抑制剂（如ERK2或p38MAPK）

钙离子在血小板聚集中起重要作用，并且能够被凝血酶、胶原或者ADP内源性或者外源性激活细胞质膜上的受体。Ca2+的增加来自于两种途径：内在的储存和通过质膜钙通道进入。G蛋白偶联受体的激活，如凝血酶受体PAR1和PAR3或者P2Y ADP[15][16]受体，均导致磷脂酶-β的激活。

此外，胶原与糖蛋白连结于血小板，并且提高了PLC的活性，通过磷酰化酪氨酸残基上的PLCγ-2。因此，两种类型的受体均能刺激从fromphosphatidylinositol二磷酸中释放三磷酸肌醇。IP3结合受体2型IP3分泌颗粒，导致人类的血小板减少，减少钙的动员[17][18][19]。这种细胞内钙离子的上调，刺激下游区的靶蛋白，包括钙调蛋白激酶，肌浆球蛋白轻链激酶和蛋白激酶C。由于这个原因，笔者认为，在胶原活化的血小板中，davallialactone的抗血小板活性是由于对钙动员的抑制。

MAPKs包括ERK、p38MAPK和JNK在血小板中可被许多激活剂激活，如胶原和凝血酶[18][19][20][21]。虽然在血小板激活过程中，ERK和p38MAPK所起的作用仍有争议[22][23]。SB203580、p38MAPK特异性抑制剂，能够抑制由胶原或凝血酶诱导的血小板的活化[24]，研究表明，ERKs在胶原和凝血酶刺激下被激活[25]，并且ERKs的激活包含于胶原诱导的血小板的聚集和分泌。在人的血小板中，ERK的级联反应需要激活储存的Ca2+内流。虽然激动剂（包括胶原和凝血酶）可以诱导钙动员，但结果显示，为了使Ca2+浓度达到使血小板活化的水平，必须有另外的Ca2+内流。因此，在胶原诱导的血小板聚集中，davallia-lactone对ERK2和p38MAPK磷酸化的抑制作用似乎对此物的抗血小板活性有部分作用，细胞外信号调节激酶1和2均能在血小板中出现。笔者发现，ERK2可被胶原和凝血酶刺激而激活。

6 结语

综上所述，由于血小板在不同疾病、不同病人和不同疾病阶段中所起的作用不同，且影响血小板聚集的因素很多，因此应通过实验研究、病理检查、不断开发具有新适应症的抗血小板聚集药物，从分子生物学角度对血小板与血栓性疾病机制进行更为深入的研究，将有助于发现新的作用靶点，为研究开发新型的抗血小板药物提供更大的发展空间。多种重要有效成分具有显著抗血小板聚集作用，但对其作用机制的阐释尚需要深入。