红菜薹小孢子培养技术研究进展

吴艺飞 ，丁茁荑 ，肖杰 ，周晓波 ，李兵

（1.湖南省蔬菜研究所，长沙，410125；2.湖南省蔬菜工程技术研究中心；3.湖南农业大学园艺园林学院；4.恒基兆佳（湖南）房地产发展有限公司）

红菜薹（Brassica compestrisssp.chinensisvar.pupureaHort.）为十字花科芸薹种白菜亚种的变种，是原产于我国长江流域的一种地方特色蔬菜。依靠常规杂交育种选育一个稳定、纯合的材料需要3～5 a，耗工、耗时，而通过小孢子培养获得单倍体后进行人工加倍，只需一个世代就可获得纯合的二倍体，作为杂交育种的亲本材料，从而大大加速育种进程。因此，小孢子培养在红菜薹遗传和育种中越来越受到重视。

1 研究概况

游离小孢子培养技术的研究始于20世纪70年代初。为了排除花药壁和绒毡层组织的干扰，直接了解小孢子胚胎发生的机理，1973年法国学者Nitsch和Norreel设计了一种从花药中直接分离小孢子的方法，将分离出来的小孢子置于液体培养基中进行薄层培养。这一方法最早用在曼陀罗、矮牵牛和烟草等茄科模式植物上，20世纪80年代以后在一些禾本科农作物、芸薹属植物上开始研究。1982年德国学者Lichter[1]率先在油菜上进行小孢子培养并获得胚状体，他发现小孢子培养产生的胚状体和再生植株要大大多于花药培养，从而引起众多育种工作者的关注。此后，游离小孢子培养在很多其他作物上相继获得成功，成为很多植物品种改良的重要手段[2～4]。

2004年王涛涛等[5]对红菜薹进行小孢子培养并率先获得成功。目前在红菜薹小孢子培养方面不断取得新的进展，研究表明，供体植株的基因型、小孢子发育阶段、亲本植株的生理状态、培养基组成成分及添加物、小孢子培养方法和培养条件等因素对小孢子的产胚率影响相当大，但再生植株群体的倍性复杂，给育种工作带来很大的难度[6]。

2 影响小孢子胚产率的因素

2.1 供体植株的基因型差异

关于供体植株的基因型与小孢子胚产率的关系研究很多，尽管所用的材料种类、培养方法等不尽相同，但几乎所有的研究结果都表明，不同基因型之间胚胎的发生频率差异非常大，同一作物不同品种采用相同的培养条件，出胚多的基因型的出胚率是出胚少的基因型的几十甚至数百倍[7，8]。

王涛涛等[5]对5个红菜薹品种进行小孢子培养中，只有3个产生了胚状体。张秀武等[9]通过试验将供试材料分为3类：易成胚材料、较易成胚材料和难成胚材料，并认为产胚量高的亲本，其后代携带亲本中较易产胚的基因，因此也有较高的胚产出率。由此可见，小孢子胚产率同很多其他遗传性状一样，也是受基因调控的性状。

2.2 生长条件、取材时期和小孢子发育阶段

大多数小孢子培养试验证明，供体植株所处的生长条件，如温度、日照时数、株龄以及植株所处的环境等对胚产率影响非常大，研究人员提出，在小孢子培养试验中，应尽量使供试植株生长在温度为15～20℃ 和14～16 h的长日照条件下，以便得到更好的培养效果。在无人工气候室的情况下，宜把供体植株花期安排在冬季或早春，以避开秋季高温、短日照等不利环境对小孢子培养的影响。邓耀华等[10]认为，红菜薹小孢子培养受气温影响很大，当气温达到10℃以上即可进行小孢子培养，红菜薹小孢子培养的最适温度为15℃。

除温度、光照等因素外，植株的株龄对小孢子胚胎发生率也有一定影响。一般宜选取盛花前期或盛花期无病害植株上健康饱满的花蕾进行培养。适宜进行小孢子培养的小孢子发育时期为单核靠边期和双核早期（花蕾长 2～3 mm，花瓣/花药=1/3～4/5）。

2.3 预处理和预培养方法

①低温预处理 即接种前将花蕾放在4℃下进行低温处理。邓晓辉等[11]的研究结果表明，接种前将供试花蕾放在4℃条件下进行低温处理，对小孢子胚产率影响不大，但当处理时间超过5 d后，胚诱导率下降明显，他认为虽然低温能减缓小孢子发育速度，但是对小孢子胚状体发生的数量无影响，因此接种前的低温处理对小孢子胚诱导率的影响效果不明显。而张秀武等[9]的试验结果表明，低温处理2 h的花蕾胚诱导率高于未经低温处理的花蕾，但随着处理时间的延长，胚发生率反而大幅下降，处理4 d以后基本没有胚状体产生。

②高温诱导 即将接种后的小孢子置于33～35℃高温下进行胚状体诱导。邓晓辉等[11]的研究认为，高温诱导改变了小孢子的发育方向，使其由花粉发育转向胚状体发育，因此是诱导小孢子出胚的关键因素，但处理时间以12～36 h为宜，超过60h后，小孢子的生理代谢受到严重破坏，小孢子活力大大下降，从而导致胚状体诱导率下降。韩笑等[12]的研究也认为，高温热激处理是促进细胞分裂和改变小孢子发育方面的主要条件，将花椰菜小孢子接种后放在32.5℃高温下预处理24 h，产胚量明显提高。

③小孢子浓度 小孢子培养时，小孢子浓度对培养效率有很大的影响，在一定范围内浓度越高，胚状体诱导率越高，浓度越低，诱导率越低，这种现象称之为密度效应。不同植物的小孢子培养的最佳培养浓度不同。肖辉等[13]认为，红菜薹小孢子培养时，最佳的小孢子浓度为5～6个花蕾/皿，用血球计数板测量密度为1×105～2×105个/mL。

2.4 培养基添加剂

①活性炭 大多数的研究结果表明，在培养基中添加适量的活性炭能提高小孢子胚的产率，且能增加子叶形胚的产量，降低畸形胚的数量。一般活性炭的添加量为0.1%～1.0%，不同品种间有一定差异。活性炭通过吸附培养基中小孢子生长发育过程中产生的酚类、酮类等有害物质，给小孢子创造更好的发育环境，从而提高胚状体诱导率，但因活性炭是无选择性的吸附，它在吸附有害物质的同时也吸附小孢子，因此当培养基中活性炭过多时，它也会吸附在小孢子的周围，使小孢子发育受阻，抑制胚状体的发生，使胚诱导率不再增加，甚至出现下降趋势[14]。

②外源激素 一般添加的外源激素为6-BA和NAA，6-BA的诱导效果比NAA显著。张秀武等[9]的研究结果表明，在一定范围内，随着6-BA浓度的升高，胚诱导率呈上升趋势，而畸形胚发生率也随之升高，这说明6-BA浓度对胚的形态及最终形成再生植株的比率影响很大，肖辉等[13]的试验也证明了这一点。6-BA的作用机理可能为：在游离小孢子体内产生与6-BA相结合的高度专一性和亲和力的受体蛋白，有些受体蛋白存在于质膜上，与激素相结合后改变质子泵活力和膜的透性；有些受体蛋白存在于细胞质和细胞核中，与激素结合后影响DNA、RNA和蛋白质的合成，并对一些特殊酶的合成起调控作用，从而诱导小孢子产生胚状体。

3 胚状体发生及植株再生的研究

3.1 胚状体的发生

一般来说，小孢子培养3～5 d开始进行第1次细胞分裂，7～10 d可形成肉眼可见的球形胚，15～20 d可出现心形、鱼雷形及子叶形胚。同芸薹属多数蔬菜一样，红菜薹小孢子胚发育也存在不同步性，同一皿内可见到各个不同发育时期的胚，而发育早期的球形、心形胚较难以诱导成苗，主要是诱导发育较好的鱼雷形或子叶形胚发育成完整植株。

3.2 植株再生成苗

邓晓辉等[11]认为，将发育较好的鱼雷形或子叶形胚转入固体培养基中，置于4℃下处理10 d后，其出苗率会大大提高。此外，他还通过试验证明，将子叶形胚接种到含琼脂1.0%以上的培养基中培养2～3周后，再转至含琼脂0.7%的培养基中培养，可以大大提高胚状体的再生成苗率，这可能是因为小孢子胚成熟后需要一个相对干燥的生长环境，因此可通过改变水势对胚状体产生一定的水分胁迫作用，从而提高再生植株的质量和成苗率。

3.3 再生植株的倍性鉴定

小孢子培养诱导的胚状体得到的再生植株通常为单倍体。然而红菜薹在培养过程中有较高的自然加倍的现象，从而导致再生植株倍性复杂，并非都是单倍体。因此，为了确定再生植株的倍性情况，对产生的植株进行倍性鉴定很有必要。目前一般通过以下几种方法对再生植株进行倍性鉴定。

①形态学鉴定 从植株的外部形态特征可以快速鉴定作物的倍性，一般来说单倍体植株个体比二倍体小，植株生长势也要弱些；通过观察花培植株的花器官形态也可鉴别植株的倍性，单倍体植株为高度不育。

②解剖学鉴定 通过分析叶片保卫细胞中叶绿体数目来鉴定植株的倍性，单倍体植株保卫细胞中叶绿体数目比二倍体植株少得多，且差值不受基因型的影响。也可通过比较植株气孔大小的差异来鉴定植株的倍性，同部位单倍体植株的气孔长度、宽度和周长均小于二倍体植株的。

③细胞学鉴定 细胞学鉴定植株倍性的方法是根尖压片法，红菜薹单倍体的染色体数目为10条（n=x=10），二倍体为20 条（2n=2x=20）。如果观察到花培得到植株的根尖染色体数为体细胞的1/2，即可确定花培植株是单倍体。

④DNA含量的测定 流式细胞仪（DNA flow cytometry）可以快速准确地测定植株DNA含量，从而确定植株的倍性，准确率可达99%以上。如果花培得到的植株DNA含量为二倍体植株的1/2，则可确定再生植株是单倍体。

3.4 再生植株的染色体加倍

可通过对小孢子培养产生的单倍体植株进行染色体加倍获得双单倍体（即DH）。由小孢子培养得到的单倍体植株有自然加倍的现象，但不同植物加倍的比例有差异，所以对单倍体植株进行人工加倍也是很有必要的。

张建军等[15]将不同材料接种在含秋水仙素的培养基中，发现可提高人工诱导叶菜类四倍体的效率，且未发现倍性嵌合体，认为通过组织培养方法诱导加倍效果比常规诱导加倍效果好。丁瑜等[16]采用秋水仙素浸泡油菜小孢子培养获得的再生单倍体植株根系的方法，使二倍体数从45%提高到75%。在红菜薹上，还未见有利用含秋水仙素的固体培养基对其进行染色体加倍的报道。由于花培得到的胚状体再生植株均为无菌苗，如果采用根尖浸泡和植株生长点滴定的方式加倍，需要多次滴定，操作上比较繁琐，且容易出现组培苗被感染或死亡的危险。因此，采用含秋水仙素的培养基培养单倍体进行加倍的方法，在成功加倍单倍体的同时会增加植株感染的风险，另外，添加秋水仙素的具体浓度尚不清楚。

4 近年来小孢子培养在育种上的应用

谢冰等[17]对小孢子培养产生的西葫芦DH群体进行研究发现，其DH群体遗传多样性丰富，有明显的超亲优势，有利于筛选出优异的自交系。姚星伟等[18]的研究也表明，供体双亲的性状决定了后代群体性状的分离程度，双亲差异程度越大，DH群体分离类型越多，选择效率越好。陈斌等[19]从辣椒DH群体中分离出抗TMV和CMV的超亲抗病资源。李真等[20]从甘蓝型油菜DH群体中获得极端抗旱基因型和极端不抗旱基因型，为抗旱相关研究及育种提供了材料。河南省农科院通过小孢子培养先后育成了豫生1号、豫新6号、豫新50、豫新60和豫新58等多个大白菜品种。北京市蔬菜研究中心也利用该技术育成了桔红心大白菜等品种。而小孢子培养应用在红菜薹育种上的文章鲜有见报，可能是由于红菜薹为地方特色蔬菜，研究起步比较晚，难度较大，因此研究工作大多集中在胚状体的诱导和植株成苗上。

5 存在的问题和展望

经过20多a国内外育种专家的共同探索，植物游离小孢子培养技术不断改进，在某些植物上已经形成了较为完善的技术体系。相对于其他作物而言，红菜薹小孢子培养的出胚率比较低，很多基因型材料甚至不产胚、培养结果重复性差、胚状体植株成苗效率不高、白化苗、玻璃化苗现象比较严重等，使其在育种中的应用具有一定的局限性，因此迫切需要提高小孢子培养技术的应用效率，建立完善、高效的红菜薹小孢子培养技术体系。

今后应在有机物、不同激素的最佳配比、培养方法改进、与易出胚品种杂交扩大基因型反应范围等方面进一步研究，提高小孢子产胚率，减少畸形胚的发生，提高再生植株的成苗率，同时，将通过小孢子培养与分子生物学方法及植株遗传学方法相结合，对胚状体发生的分子调控机制进行研究，以期达到人工调控单倍体培养的目的，从而建立高效、稳定的获得DH群体的游离小孢子培养技术体系。

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