阿尔茨海默病中β－淀粉样蛋白损伤血脑屏障的干预新靶点：晚期糖化终产物受体

万文斌，夏世金，刘露梅，李亚明＊

（1.复旦大学附属华东医院中医科，上海 200040；2.复旦大学附属华东医院上海市老年医学研究所，上海 200040）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是老年痴呆的最常见类型，脑内β－淀粉样蛋白（βamyloid protein，Aβ）沉 积 形 成 老 年 斑 （senile plaques，SPs）和过度磷酸化tau蛋白形成神经纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFT）是 AD的特征性病理变化［1］。越来越多的证据显示，Aβ损伤脑血管内皮细胞（endothelial cells，ECs）而引起血脑屏障（blood－brain barrier，BBB）破坏可能是 AD 新的特征性病理改变［2，3］，因为90%以上的 AD患者均存在BBB损伤［4］。然而Aβ损伤ECs引起BBB破坏的机制尚不清楚［1－4］。

近年来学者们开始认识到散发型／晚发性AD（sporadic／late－onset AD，SAD／LOAD）与脑内 Aβ清除减少有关［5］。脑内Aβ清除途径主要包括细胞外降解、细胞吞噬消化及经BBB转运清除［4］。晚期糖化终产物受体（receptor for advanced glycation end－products，RAGE）是 BBB上参与 Aβ转运的重要载体［6］，生理条件下 RAGE和低密度脂蛋白受体相关蛋白－1（LDH receptor related protein－1，LRP－1）协调作用维持脑组织Aβ在正常水平，但在AD中，RAGE表达明显上调，RAGE转运大量Aβ入脑［6］。RAGE能介导Aβ的神经毒性，又能通过正反馈机制上调自身表达使Aβ入脑沉积而促进AD发病［7］，可见RAGE在AD发病中的重要作用。本文就BBB－RAGE在AD发病中的作用进行综述，以探讨RAGE介导Aβ损伤BBB结构完整性的可能机制，以期成为干预Aβ损伤BBB的新靶点。

1 BBB在AD发病中的作用

1.1 BBB结构完整性与AD

BBB由脑微血管内皮细胞（brainmicrovascular endothelial cells，BMECs）、星 形 胶 质 细 胞（Astrocyte，AS）及周细胞（Pericyte）共同组成［8－10］，是机体最重要的内部屏障之一［8］。紧密连接（tight junction，TJ）是BMECs的主要特征结构，是BBB结构完整性（BBB structural integrity）的重要结构基础，在保持黏膜上皮的物理屏障功能和通透性方面起到了极为重要的作用［11］。整合膜蛋白Claudin、闭锁蛋白Occludin及连接粘附分子（junction adhesive molecule，JAM）3种跨膜蛋白通过胞质附着蛋白 Zonula Occluden－1，2，3（ZO－1，2，3）与骨架蛋白 Actin连接构成 TJ系统［11－13］。分子生物学研究已证实TJ在BBB通透性调节的中心作用，AD、脑卒中、蛛网膜下腔出血等病变均存在BBB结构破坏［14－16］。BBB结构完整性与TJ正常组合开放及关闭有关，TJ蛋白异常或结构重排均能引起 TJ结构改变［14－16］。

BBB保证了脑组织免于外周血液循环中毒性物质的损害，维持脑组织内环境稳态［8］。Aβ沉积在脑血管系统形成脑淀粉样血管病（cerebral amyloid angiopathy，CAA）［4］，引起神经血管功能障碍而出现认知减退及神经退行性变，因此学者们提出了AD的神经血管假说［17－19］，认为 BBB对 Aβ转运清除能力下降导致脑内Aβ沉积，引起血管功能紊乱、神经血管解耦连、血管退化、脑血流灌注不足及神经血管炎症。Aβ损伤ECs，降低TJ蛋白含量，破坏BBB上 TJ系 统［20－22］，AD 患 者 BBB 上 TJ损 伤，Claudin－1、Claudin－5明显减少［2］。因此认为，Aβ对内皮细胞的毒性作用引起TJ损伤而破坏BBB结构完整性。

1.2 Aβ转运体与AD

脑内Aβ清除途径主要包括胶质细胞吞噬消化［23］、脑间质液（interstitialfluid，ISF）中 Aβ降解酶（Aβ－degrade enzymes，ADEs）水解［24］及BBB对 Aβ的转运清除［25］。生理条件下ISF中ADEs只能清除脑内Aβ的10%～15%，胶质细胞的吞噬消化作用也相对有限，大部分Aβ通过BBB转运途径清除［25］。

对 Aβ 转 运 体 的 研 究 发 现［26，27］，LRP－1 和RAGE对Aβ均有很强的转运能力，LRP－1将ISF中Aβ转运至外周循环，而RAGE则将血液中的Aβ转运至ISF。LRP－1介导ECs以内吞或转胞吞的方式将Aβ跨过BBB排入外周循环，LRP－1异常导致Aβ外排减少，引起Aβ沉积［26］。据估算，若终止Aβ内向转运，经LRP－1外向运输1min可清除脑内几乎所有生理水平的 Aβ［26］，因此，如果上调LRP－1表达能促进Aβ外排，减少脑内Aβ沉积。BBB上的另一个Aβ转运载体RAGE可在纳摩尔水平结合外周循环中的 Aβ，并将其转运入脑［27，28］。阻断 Aβ外向转运，经RAGE内向转运40min后脑内可溶性Aβ将全部被外周循环中的Aβ充满［29］。生理条件下，LRP－1和RAGE协同作用维持脑内Aβ的正常水平，但在 AD中，BMECs上RAGE表达明显上调［30，31］。RAGE表达上调能增加外周循环中的Aβ入脑，促进脑内Aβ沉积，可见RAGE对Aβ转运在AD发病中有重要作用。此外，BBB上P－糖蛋白（P－glycoprotein，P－gp）也参与了 Aβ转运，P－gp将脑内Aβ透过 BBB 转运至外周［32，33］，但与 LRP－1相比，P－gp对Aβ的转运作用较弱。也有认为P－gp的作用是协助LRP－1对 Aβ的转运，LRP－1负责将ISF中Aβ转运入BMECs，P－pg则调节Aβ从BMECs中转运至外周循环的过程［6，33］。

2 RAGE在AD发病中的作用

RAGE是晚期糖化终末产物（advanced glycation end－products，AGEs）的一种特征性细胞表面受体，属于免疫球蛋白超家族成员，在单核细胞、血管内皮细胞、神经元及胶质细胞均有表达［28，34］。RAGE除与 AGEs结合外还能与 Aβ、高速泳动族盒蛋白－1（High mobilitygroup box 1，HMGB－1）、S100／钙粒蛋白家族等配体结合调节细胞病理生理反应［34］。近年研究［30］发现，Aβ能上调脑内RAGE水平，并能通过RAGE活化细胞内信号通路，引起氧化应激、炎症损伤。因此，RAGE不仅能通过转运Aβ入脑促进Aβ沉积［27，28］，还能激活炎症反应损伤脑组织而促进AD发病［30］。健康成人脑组织仅表达极少量的RAGE，但在AD中，RAGE的分布范围扩大并且表达明显上调［28］。AD大脑海马、额叶、齿状回及颞叶RAGE表达均有明显增加，而在 Aβ沉积少、神经炎症轻的小脑，RAGE的表达未见明显变化［35］。Aβ与RAGE结合促进活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成、激活炎症反应，并通过激活核转录因子－κB（nuclear factor－κB，NF－κB）形成一种正反馈，促进更多的RAGE表达，进一步加重神经炎症损伤效应［36，37］。

小胶质细胞（microglia）是脑内主要的免疫细胞，生理状态下，RAGE、CD47等膜表面受体在小胶质细胞吞噬消化Aβ过程中发挥作用，对神经细胞有保护作用。但在AD中，Aβ含量增加超过了小胶质细胞的吞噬清除能力，相反，Aβ与RAGE结合激活细胞内信号转导通路，小胶质细胞通过释放大量促炎症因子损伤神经元，破坏脑内环境稳定，同时Aβ－RAGE又能激活NF－κB，上调RAGE表达，形成炎症损伤正反馈效应［36－39］。在BBB上，RAGE表达增加，血中Aβ经RAGE转运入脑，加重了Aβ沉积，同时Aβ又能促进RAGE进一步表达增加并能损伤内皮细胞 TJ，破坏BBB［29－31］。

3 Aβ－RAGE信号通路与BBB损伤

BBB上RAGE与Aβ相互作用活化细胞内信号转导通路引起细胞损伤，并通过激活NF－κB正反馈上调RAGE表达，进一步促进Aβ入脑沉积及细胞损伤，破坏 BBB－TJ［36，37］。目 前 RAGE 介导 Aβ破坏BBB的机制仍不清楚，可能与MAPKs、Ca2＋、炎症损伤信号途径等有关［40，41］。

3.1 Aβ－RAGE－MAPKs－MMPs信号通路

病理条件下，基质金属蛋白酶 （matrix met alloproteinases，MMPs）能通过降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM）促进动脉粥样硬化、肿瘤浸润和转移，以及AD、脑梗死、多发性硬化等疾病的发生发展［42］。研究［40］证实，BBB通透性增加与MMPs表达增加有关，而抑制MMPs基因后表现出对大脑的保护作用，且主要是降低BBB通透性。脑缺血动物脑内ZO－1减少了近30%，Claudin－5、Occludin含量也明显减少，MMP－9基因敲除后ZO－1未见明显变化［43，44］。置于脉冲电磁场（Pulsed Electromagnetic Field，PEMF）的小鼠脑血管内皮细胞 MMP－2、MMP－9增加，ZO－1明显减少，TJ结构损伤［45］，可见MMPs在TJ损伤中的作用。

最近有文献［2］报道，AD患者BBB通透性增加，ECs MMP－2、MMP－9表达显著，Claudin－1、Claudin－5表达减少。Aβ－RAGE相互作用能增加内皮细胞MMP－2、MMP－9表达，减少Claudin－1、Claudin－5含量，损伤 TJ结构［2，46］，而阻断 Aβ与 RAGE结合能抑制Aβ诱导的大脑内皮细胞 MMPs表达［46］。可见，Aβ 损 伤 BBB 可 能 与 RAGE 诱 导 MMP－2／MMP－9表达增加有关，但调控机制尚不清楚。细胞 外 信 号 调 节 激 酶 （extracellular－signal－regulated kinases，ERK），c－Jun－氨 基 末 端 激 酶 （c－Jun N－terminal kinase，JNK）及p38－丝裂原活化蛋白激酶（p38－mitogen－activated protein kinases，p38－MAPKs）等丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases，MAPKs）途径是重要的细胞信号转导通路［47，48］。一项AGEs损伤 HaCaT角质细胞的研究［47］发现，AGEs能上调HaCaT角质细胞表达 MMP－9，利用基因干扰技术明确了RAGE在AGEs诱导MMP－9表达中的关键作用，进一步研究证实MAPKs信号转导通路参与了这一过程，因为ERK1／2及p38－MAPK拮抗剂能抑制MMP－9表达。另一项关于蛛网膜下腔出血的研究［48］发 现，JNK 抑 制 剂 能 通 过 增 加 Clautin－5 和ZO－1表达而保护BBB免受损伤。可见，MAPKs可能参与了BBB损伤过程，MMPs可能参与了其下游调控过程。

3.2 Aβ－RAGE－Ca2＋－Calcineurin信号通路

TJ信号调节以Ca2＋调节为主，还包括胶质细胞调节、磷酸化调节及蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）调节等方式，调控 TJ的形成与分解［41］。Ca2＋参与了各种细胞间连接的形成，对TJ正常功能的维持有重要作用［41］。胞外低浓度Ca2＋干扰细胞TJ形成，增加Ca2＋浓度可诱导TJ重新形成［49，50］。研究［41］证 实，胞 外 Ca2＋对 TJ的 影 响 与PKC和蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）信号通路有关，因为低Ca2＋对TJ的影响可通过PKC的活化及PKA的抑制而得以改善，而胞内Ca2＋是通过改变ZO－1／Actin的结合并改变细胞内Occludin的位置影响TJ形成。Aβ能直接或间接引起Ca2＋向胞质内流［51］，Ca2＋浓度改变影响TJ的形成或导致结构稳定性破坏［41］，因此RAGE诱导Aβ损伤TJ也可能与改变Ca2＋浓度有关。钙调磷酸酶（Calcineurin，CaN）是 唯 一 受 Ca2＋／钙 调 素（Calmodulin，CaM）调节的丝氨酸／苏氨酸蛋白质磷酸酶。体外实验发现，Aβ损伤TJ蛋白，增加BBB通透性，并能增加内皮细胞Ca2＋浓度，抑制RAGE或CaN活性，能阻断Aβ诱导的TJ损伤，改善BBB通透性［52］。因此，Ca2＋可能也参与了BBB的损伤，CaN作为Ca2＋／CaM信号通路的重要磷酸酶在Aβ－RAGE损伤TJ中有重要作用。

3.3 Aβ－RAGE－炎症信号通路

Aβ作为配体识别RAGE的胞外V域，激活细胞内信号转导途径，一方面激活NADPH氧化酶途径产生ROS，另一方面激活NF－κB，引起内皮素因子－1（endothelin－1，ET－1）、促炎症细胞因子白介素－1β（Interleukin－1β，IL－1β）、IL－6、肿 瘤 坏 子 因 子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）表达增加，同时NF－κB的活化又能上调RAGE表达而形成炎症损伤的正 反馈效 应［36－39］。因此，Aβ与 RAGE 相互作用触发ROS生成并激活炎症通路，损伤脑组织从而促进AD发病。NF－κB的激活作为一种正反馈促进RAGE表达上调，同时ROS的生成也会放大受体的生成和加重炎症过程，引起持久的神经炎症反应，造成内皮细胞损伤凋亡，最终破坏BBB结构完整性，ET－1使脑血流（cerebral blood flow，CBF）降低并能促进脑血管重构［28，35，53］，参与 Aβ引起的 CAA形成［4］。

Aβ神经毒性损伤是破坏BBB结构完整性，促进AD发病的重要因素，但其机制尚未明确［1］。RAGE拮抗剂抑制Aβ诱导的NF－κB激活，并可能阻断细胞炎症激活［28］。在RAGE基因敲除小鼠脑中也未检测到Aβ跨过BBB入脑，而给予外源性Aβ后只能检测到微量的炎症反应［25］。

4 RAGE在AD防治中的作用

RAGE介导Aβ的神经毒性提示RAGE是促进AD病理进展的关键因子，因为抑制RAGE的作用能阻断Aβ引起的细胞信号转导通路活化［52］，因此RAGE可能成为新的AD治疗靶点。基于RAGE在AD发病中的重要作用，通过降低RAGE表达、抗体封闭RAGE蛋白、药物竞争性阻断RAGE与Aβ结合的信号通路，将可能阻断 Aβ－RAGE对细胞的损伤效应。RAGE活性拮抗剂或RAGE基因敲除能减缓动物神经退行性病变进程，抑制慢性炎症及氧化应激产物形成［27，28］。最近，RAGE－Aβ结合竞争性抑制剂PF－04494700被证实对治疗轻中度AD有效，并已用于Ⅱ期临床实验，但因大剂量时出现不良反应而被中止。随访发现，小剂量使用的AD患者未见明显不良反应，虽然已停用PF－04494700，但随访6个月后患者认知水平较用药前及停药前均有提高［54－56］。

可溶性 RAGE（soluble RAGE，sRAGE）是RAGE的一种亚型，AD早期患者血清中sRAGE浓度明显降低，因此sRAGE可能成为AD诊断的标志物［57］。sRAGE不能穿过BBB，可作为诱饵受体与外周循环Aβ结合形成sRAGE－Aβ复合物，阻止Aβ入脑而影响AD病情发展［57］。给AD小鼠静脉注射sRAGE，3个月小鼠海马Aβ减少了70%，小鼠空间识别与学习能力也明显高于对照组［58］。

除RAGE活性抑制及诱饵受体外，中药对RAGE也有良好的干预作用。银杏叶提取物EGb761能降低BMECs的RAGE表达，减少RAGE介导的Aβ转运入脑［59］。体外实验也证实，EGb761能抑制RAGE mRNA及蛋白表达［59］。

5 小结与展望

AD是一种慢性进行性神经系统退行性病变，到2050年，全球每85人中将有1人患有AD［60］。AD病因及发病机制尚不完全清楚，目前无特效治疗手段［1］。Aβ是脑内正常的代谢产物之一，生理浓度的Aβ具有促进突触功能及调节神经元活性等作用［61］。但 在 AD 中，淀 粉 样 蛋 白 假 说 （amyloid peptide cascade hypothesis）认为过量Aβ沉积及其神经毒性作用是AD发病的关键［1］。RAGE可能是介导Aβ神经毒性的重要调节因子，其表达上调不仅造成血管内皮及神经细胞自身炎症反应，并能促进 Aβ 入 脑 沉 积 而 加 重 AD 病 变［36，37］。TJ 是BMECs间的重要结构，是BBB正常功能的基础，Aβ损伤BMECs破坏BBB结构完整性。RAGE介导Aβ损伤TJ的机制尚未明确，可能与多种细胞内信号转导通路、Ca2＋或炎症损伤有关。虽然RAGE的正常生理作用尚不清楚，但抑制RAGE能阻止Aβ对神经细胞及脑血管系统的损害，有可能成为缓解或阻止AD发生发展的新的干预靶点，从而为防治AD提供新的思路。

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