响应面法优化水酶法提取林蛙卵蛋白

季晓枫， 林 凤， 邱芳萍＊

（1.长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春 130012；2.吉林大学生命科学学院，吉林长春 130012）

0 引 言

林蛙是水陆两栖动物，常在没有强烈光照、湿润凉爽的环境中生活，以多种昆虫为食，9月下旬至10月初从山坡林区迁到河沟附近，陆续进入水底集群冬眠。少数在泥间或树根下越冬，次年清明前后复苏。林蛙浑身是宝，且可直接食用，关于林蛙油的研究报道很多，但对林蛙卵的研究和报道甚少。有报道林蛙卵富含丰富的蛋白质、脂肪、维生素、氨基酸及雄性激素睾丸酮、雌性激素孕酮、雌二醇、雌三醇和磷脂等。它具有提高免疫力、调节血脂、延缓衰老、预防妇女更年期综合症等功效［1－4］。以林蛙卵为原料，利用响应面法对最佳酶解条件进行了分析，为林蛙卵的开发及利用提供了理论基础和实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜林蛙卵，购于吉林省靖宇县；

碱性蛋白酶，活力1.2×105U／mL；

LDZ5-2型台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂；

二十孔消化炉，上海纤检仪器有限公司；

KDN-04Ш型蛋白质测定仪，上海纤检仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分析检测方法

水分的测定：依据GB5009.3-2010。

粗脂肪的测定：依据GB／T14772-2008。

粗蛋白的测定：依据GB5009.5-2010。

灰分测定：依据GB／T5505-2008。

1.2.2 工艺流程

新鲜林蛙卵→干燥粉碎→配液→调pH和温度→蛋白酶酶解→升温灭酶→过滤得残渣→测残蛋白→调pH和温度→活性炭脱色→过滤→离心分离→水解液喷雾干燥。

1.2.3 操作要点

取50g新鲜林蛙卵粉干燥粉碎，按一定比例加入蒸馏水，置于恒温水浴锅中并利用搅拌器进行不断搅拌，用稀释的NaOH溶液调节pH值，并加入一定量的碱性蛋白酶，在恒温下进行酶解，经过一定时间后，升温至100℃灭酶5min，过滤残渣，最后进行离心分离，得水解液，喷雾干燥得到林蛙卵蛋白。林蛙卵蛋白提取率计算如下：

1.2.4 碱性蛋白酶提取林蛙卵蛋白的单因素实验

1）加酶量对林蛙卵蛋白提取率的影响。按1.2.3所述方法，料液比分别为1∶6，酶解温度为50℃，酶解时间为3h，pH值为9，加酶量分别选取0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%。

2）温度对林蛙卵蛋白提取率的影响。按1.2.3所述方法，料液比为1∶6，酶解温度分别为40，45，50，55，60，65℃，酶解时间为3h，pH值为9，加酶量选取2%。

3）时间对林蛙卵蛋白提取率的影响。按1.2.3所述方法，料液比为1∶6，酶解温度为50℃，酶解时间分别为2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0h，pH值为9，加酶量选取2%。

4）料液比对林蛙卵蛋白提取率的影响。按1.2.3所述方法，料液比分别为1∶3，1∶4，1∶5， 1∶6，1∶7，1∶8，酶解温度为50℃，酶解时间为3h，pH值为9，加酶量选取2%。

5）pH值对林蛙卵蛋白提取率的影响。按1.2.3所述方法，料液比为1∶6，酶解温度为50℃，酶解时间为3h，pH值分别为7，8，9，10，11，12，加酶量选取2%。

1.2.5 碱性蛋白酶提取林蛙卵蛋白响应面试验设计

在单因素试验的基础上，确定了各因素的水平值范围，并采用响应面中心组和试验设计，研究各酶解参数对考察指标的影响规律。选取加酶量、酶解温度、酶解时间、料液比和酶解pH值5个因素为自变量，以林蛙卵蛋白提取率为响应值，优化林蛙卵蛋白提取工艺的最佳参数。其因素水平编码表见表1。

表1 响应面设计因素和水平

1.3 数据处理

采用design expert软件对试验数据进行分析［5－6］。

2 结果与讨论

2.1 林蛙卵的主要成分

本实验用林蛙卵的主要成分见表2。

表2 林蛙卵成分分析表 %

2.2 碱性蛋白酶提取林蛙卵蛋白的单因素实验结果

加酶量对林蛙卵蛋白提取率的影响如图1所示。

图1 加酶量对林蛙卵蛋白提取率的影响

加酶量低于2%时，随着加酶量的增加，提取率显著上升，当加酶量达到2%时，提取率接近最大值，超过2%时，提取率的变化不明显，趋于稳定。由于酶的价格比较昂贵，考虑到经济效益，在提取率近乎相等的条件下，最佳的加酶量为2%。

酶解温度对林蛙卵蛋白提取率的影响如图2所示。

图2 酶解温度对林蛙卵蛋白提取率的影响

在温度低于55℃时，林蛙卵蛋白提取率随着温度的升高而增加，主要由于温度越来越接近酶的最适温度，酶的活性增加，酶对底物的作用明显，因此，提取率随着温度的升高而增加，当温度高于55℃时，提取率随着温度的升高而降低，因此最适温度为55℃。

酶解时间对林蛙卵蛋白提取率的影响如图3所示。

图3 酶解时间对林蛙卵蛋白提取率的影响

当时间低于4.0h时，提取率呈上升趋势，变化程度较明显，时间继续增加时，提取率缓慢增加而后又略有降低，从时间合理化的出发点考虑最适酶解时间为4.0h。

料液比对林蛙卵蛋白提取率的影响如图4所示。

图4 料液比对林蛙卵蛋白提取率的影响

随着料液比的降低，提取率先升高而后下降，在1∶5时出现峰值。因此最适料液比为1∶5。

pH值对林蛙卵蛋白提取率的影响如图5所示。

由图5可知，当pH值低于9时，随着pH值的增加，提取率逐渐增加，当pH值为9时，提取率接近最高值，但随着体系pH值增大，虽然提取率增加，但会带入过多的碱，使所得的蛋白含盐量增加，给蛋白的进一步利用带来限制。因此最适宜的pH值为9。

图5 pH值对林蛙卵蛋白提取率的影响

2.3 碱性蛋白酶提取林蛙卵蛋白响应面试验结果

在单因素实验的基础上，综合考虑经济效益及林蛙卵蛋白品质，确定各因素的最佳水平值范围，采用响应面中心组和试验设计，研究各酶解参数对考察指标的影响规律，并得到酶解的最佳条件［7］。以各酶解工艺参数加酶量A、酶解温度B、酶解时间C、料液比D、pH值E为自变量，以提取率为响应值。响应面实验方案及结果见表3。

表3 响应方案及结果

续表3

2.4 碱性蛋白酶提取林蛙卵蛋白响应面试验结果分析

通过统计分析软件design expert进行数据分析，建立二次响应面回归模型如下：

进一步对该回归模型进行显著性检验，响应曲面数据的方差分析结果见表4。

表4 回归与方差分析结果

由表4可知，AB，AC，AD，CD，DE，CE模型显著，方程因变量与自变量之间的线性关系明显，该模型回归显著（p＜0.001），失拟项不显著，并且该模型R2＝99.92%，R2Adj＝99.86%，说明该模型与实验拟合良好，自变量与响应值之间线性关系显著，试验误差小，可以用该方程代替真实试验点进行分析。按照得到的数学模型绘制响应曲面，如图6所示。

图6 各因素交互作用对提取林蛙卵蛋白提取率影响的响应面

2.5 条件优化

由F检验可以得到因子贡献率为：A＞D＞B＞C＞E，即加酶量＞料液比＞酶解温度＞酶解时间＞酶解pH值。利用响应面软件对边界值和求得的极值进行分析，得到最佳提取条件为：加酶量1.9%，温度58℃，酶解时间4h，料液比1∶5，pH值8.8。在响应面分析法求得的最佳条件下进行平行实验（3次），平均值为9.63%。响应值的实验值与回归方程预测值吻合良好，说明该模型能够较好地预测实际林蛙卵蛋白提取率情况［8］。

3 结 语

本试验选用碱性蛋白酶提取林蛙卵蛋白，利用响应面进行优化，使得林蛙卵蛋白的提取率达到最佳。本试验为校企合作研制和开发林蛙卵蛋白的相关产品提供了理论依据，为其大规模工业化生产奠定了基础。本研究将从更大的深度上挖掘长白山林蛙资源，开发新的终端产品，增加林蛙加工品种，促进长白山林蛙亚种产业系的现代化、高值化发展。

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