苯基硫醚的合成及其衍生化性能＊

李迎红，管向明，宋丹青

(1.中国医学科学院医药生物技术研究所，北京 100050;2.美国南达科他州立大学药学系，南达科他州布鲁金斯 57007)

巯基化合物在细胞信号传导［1］及维持机体氧化还原稳态［2～3］等方面发挥着重要作用。长期以来，巯基/二硫键水平一直被作为衡量体内氧化应激水平的重要指标［4～5］。人们一直致力于寻找合适的巯基衍生化方法对其进行含量分析［6～8］，其中，monobromobimane［9］，7-fluoro-2，1，3-benzoxadiazole-4-sulfonate(SBD-F)以及4-aminosulfonyl-7-fluoro-2，1，3-benzoxadiazole(ABDF)因具有良好的透膜性和高度的巯基反应性和选择性而备受关注［10～12］。但是，这些亲电性试剂都不是巯基专一性的，除了巯基外，它们还能与其它亲核性基团，如-OH，-CO2H和-NH2反应，极大地限制了其应用［13～14］。

除了通过基因工程引入适当荧光性蛋白的方法［15］外，目前二硫醚是唯一公认的能与巯基专一性反应的结构类型，其中应用最广泛的是埃尔曼试剂［5'，5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)］，其特异性原理在于巯基特异性的巯基-二硫键置换反应［16］。类似原理的小分子巯基专一性试剂还有n-octyldithionitrobenzoic acid(OTNB)［17］，4，4'-dithiodipyridine(4-DTDP)［18］等。2006 年，Pullela 等［14］将这一原理应用于大分子所制备的大分子二硫醚化合物同样具有巯基专一性。但是，这些小分子二硫醚化合物普遍存在极性过大透膜性低的问题，而大分子二硫醚化合物与巯基的反应性又过低［14］。到目前为止，在二硫醚化合物中还未能发现能够用于生物体内巯基定量分析的理想试剂。

在前期寻找巯基特异性标记试剂的研究中，我们首次发现并证明了一类全新结构的化合物——苯并-2，1，3-噁二唑硫醚，能够特异性的快速的与巯基反应，而且也表现出良好的膜透性［19］，显示出其在生物体内巯基定量分析的潜在应用前景。这一结果提示我们，芳香硫醚很有可能是巯基专一性反应试剂的一类新的结构骨架。

在该类硫醚化合物中，苯环上的2，1，3-噁二唑，硝基以及砜基均为强吸电子基团。由此我们推测，二苯基硫醚结构是巯基专一性反应的决定性结构单元，而苯环上吸电子基团的引入实则加速了其与巯基的反应。因此，本文设计并合成了结构更为简化的2，4-二硝基苯基硫醚(2a)和对硝基硫醚(2b，Scheme 1)，其结构经1H NMR和13C NMR表征。通过考察2a或2b与巯基代表化合物NAC(N-乙酰基半胱氨酸)的反应以探讨不同吸电子基团对反应活性的影响，以及与亲核性代表化合物色氨酸的反应，来探索其对巯基基团的反应专一性。

Scheme 1

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CXM-300型精密熔点仪(温度未经校正);ZF-1型三用紫外分析仪;Varian Inova 400型和Bruker AvanceⅢ400型核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂，TMS为内标);Orbitrap型液质联用仪;Agilent 1 260型高效液相色谱仪［HPLC，Waters ODS C18 反相柱(4.6 m ×150 mm，5 μm)，柱温 25℃，检测波长254 nm;流动相，0.1%H3PO4水溶液(A)和乙腈(B);洗脱梯度Q=V(B)∶V(A)=40∶60，0 min～2 min;Q=40 ∶60～80 ∶20，2 min～12 min;Q=80 ∶20，12 min～18 min;Q=80 ∶20 ～40 ∶60，18 min ～18.1 min;Q=40 ∶60，18.1 min ～23 min;流速0.8 mL·min-1］;CombiflashRf 200型Flash柱。

预铺硅胶铝箔卷，Merck 公司;0.5 mol·L-1Tris缓冲液，pH 8.0，2.0 mmol·L-1EDTA;其余所用试剂均为分析纯。

1.2 合成

(1)2a的合成

氮气保护下，在三口瓶依次加入乙腈30 mL和1a 2.16 g(10 mmol)，搅拌使其完全溶解;滴加NaSH 0.28 g(5.0 mmol)的 0.5 mol·L-1Tris缓冲溶液30 mL，滴毕，于70℃反应1 h(TLC跟踪)。减压浓缩，残余物经Flash柱纯化得黄色固体2a 1.56 g，收率85.2%，m.p.192 ℃ ～193 ℃;1H NMR δ:8.97(d，J=2.3 Hz，1H)，8.5(dd，J=2.4 Hz，8.8 Hz，1H)，7.8(d，J=8.8 Hz，1H);13C NMR δ:149.2，147.4，138.0，135.7，128.5，121.5(与文献［20］数据一致)。

用类似方法合成2b(反应时间8 h)1.45 g，收率 87.6%，m.p.159 ℃ ～160 ℃;1H NMR δ:8.24(d，J=8.7 Hz，1H)，7.64(d，J=8.7 Hz，1H);13C NMR δ:146.61，143.46，141.94，131.15，126.60，124.67(与文献［21］数据一致)。

(2)3a的合成

氮气保护下，在反应瓶中依次加入2a 0.37 g(1.0 mmol)，乙腈 20 mL 和 NAC 0.30 g(2.0 mmol)的0.5 mol·L-1Tris缓冲溶液20 mL，搅拌下于室温反应过夜(TLC跟踪)。减压浓缩除去溶剂，残余物经Flash柱纯化得3a 0.18 g，收率54.7%;1H NMR δ:8.9(d，J=2.40 Hz，1H)，8.4(dd，J=2.4 Hz，9.0 Hz，1H)，8.4(d，J=7.7 Hz，1H)，7.80(d，J=9.1 Hz，1H)，4.50(td，J=7.9 Hz，4.6 Hz，1H)，3.64(dd，J=13.1 Hz，4.6 Hz，1H)，3.40(dd，J=13.0 Hz，8.3 Hz，1H);13C NMR δ:171.9，170.0，145.6(2C)，145.3，144.2，128.8，127.9，51.4，34.5，22.8;HR-ESI-MSm/z:Calcd for C11H11O7N3S{［M -H］-}328.023 43，found 328.023 40。

用类似方法合成3b(于80℃反应12 h)0.20 g，收率 35.2%;1H NMR δ:8.4(d，J=7.9 Hz，1H)，8.2(d，J=8.8 Hz，1H)，7.6(d，J=8.8 Hz，1H)，4.5(td，J=8.0 Hz，5.0 Hz，1H)，3.6(dd，J=13.5 Hz，4.8 Hz，1H)，3.4(dd，J=13.5，8.3 Hz，1H)，1.86(s，3H);13C NMR δ:172.0，169.7，147.2，144.7，126.6(2C)，124.0(2C)，51.8，33.2，22.5;HR-ESI-MSm/z:Calcd for C11H12O5N2S{［M - H］-}238.038 64，found 238.038 32。

1.3 巯基反应性考察

在反应瓶中加入等体积的1 mmol·L-12a(或2b)的乙腈溶液和 2 mmol·L-1NAC 的 0.5 mol·L-1Tris缓冲液，搅拌使其混合均匀，反应至0.5 h和4.0 h分别取反应液用HPLC检测。

1.4 巯基反应专一性考察

在反应瓶中加入等体积的1 mmol·L-12a(或2b)的乙腈溶液和含50 mmol·L-1色氨酸的0.5 mol·L-1Tris缓冲液，分别于室温和60 ℃下搅拌混合均匀，于12 h取反应液用于HPLC检测。

2 结果与讨论

由于巯基极易被氧化，因此硫醚2a和2b及其NAC衍生物3a和3b的合成均需在氮气保护下进行。所用的质子性溶剂均为弱碱性的Tris缓冲液，以使巯基能始终以负离子形式存在，增强其反应性，加快反应速度。EDTA的作用在于络合溶剂中可能存在的各种金属离子，从而保护巯基不被氧化［22］。

硫醚2a表现出良好的巯基反应性。根据HPLC检测结果，4 h时NAC已将2a完全定向转化NAC衍生物3a(保留时间为7.451 min)。NAC与2b在此条件下基本不反应，相应的NAC衍生物3b在长时间加热条件(80℃，12 h)下才能生成。该结果表明二苯基硫醚苯环上的电子云密度明显影响反应活性，相比之下，2，4-二硝基取代使之更易于与巯基发生发应。

由于色氨酸中含有-OH，-CO2H和-NH2三种常见亲核基团，是考察硫醚化合物巯基专一性的理想受试物。在色氨酸50倍过量时，无论是室温还是加热条件下，2a都能保持稳定12 h以上。而在室温条件下，只需要1倍过量的NAC即可将2a 100%转化，这表明了2a与巯基反应的专一性。2a对NAC的反应性明显高于2b;2a对-OH，-CO2H和-NH2均表现出明显的化学惰性。

综上所述，二苯基硫醚是一类巯基专一性反应试剂，苯环上适当的吸电子基团可优化其与巯基的反应活性。本研究结果为巯基专一性反应试剂增加了一个新的结构类型，为巯基标记试剂的设计提供一种新的设计思路。

致谢:感谢中国医学科学院药物研究所测定核磁共振数据，感谢中国医学科学院医药生物技术研究所分析测试中心测定ESI高分辨质谱数据。

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