槲皮素干预下HBx基因对人肝癌细胞侵袭、迁移、增殖的影响

成碧萍，苏 杰，姚 杨，白跳艳，徐 锐(西安医学院第一附属医院中心实验室，西安 710077;通讯作者，E-mail:yaoyang1220@sina.com)

流行病学和分子生物学研究认为，乙型肝炎病毒(HBV)是HBV相关性肝癌(HCC)发生的高危因素，HBx是HBV 4个开放读码框架中X编码的一种病毒多功能蛋白，研究发现，X基因表达产物(HBx)在肝癌形成过程中参与肝癌血管生成［1］，可能通过多种复杂的细胞信号转导途径参与细胞凋亡、DNA修复调控，促进细胞周期进程，与HCC的发生、发展具有密切的关系［2，3］。因此，以 HBx作为肝癌基因治疗靶点具有一定的临床应用前景。随着对肿瘤治疗研究不断的深入，发现广泛存在于多种水果和蔬菜中的黄酮类化合物有抗肿瘤的作用［4］。近年来研究［5］表明，槲皮素能够抑制多种肿瘤细胞的增殖、转移，能够诱导多种肿瘤细胞凋亡及增强其他抗肿瘤药物作用的敏感性。本文就槲皮素对体外培养的人肝癌HepG2细胞及稳定转染 HBx基因的HepG2-X的侵袭、迁移及增殖的影响进行了研究，进一步探讨槲皮素的功能及其可能机制，另外，本文研究HBx在槲皮素干预下对HepG2细胞增殖的影响，探讨HBx致肝细胞恶性转化的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌HepG2及HepG2-X细胞株由西安医学院附属医院中心实验室提供，槲皮素购自美国Sigma公司，用二甲基亚砜(DMSO)溶解后-20℃保存，实验时用RPMI1640培养基稀释。MTT和DMSO购自美国Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程研究所。

1.2 细胞培养

从液氮罐中取出冻存管，40℃水浴融化，1 500 r/min离心3 min后弃上清;沉淀物用RPMI1640完全培养液混悬后适量培养液稀释，转入无菌培养瓶;在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下的孵箱中培养;次日更换培养液，继续培养。每2 d换液1次，待细胞铺满70%-80%培养瓶时，用2.5 g/L的胰酶消化，完全培养基终止反应，滴管吹打为单个细胞，1∶4分瓶传代。选择对数生长期的细胞收集，在收集前1 d换液1次，用胰酶消化为单个细胞悬液，离心，弃上清，加入冻存液，以1×106/ml的密度混悬细胞，将细胞悬液转至冻存管，标记好后置于4℃冰箱30 min，转至-20℃冰箱2-3 h，然后放入-80℃冰箱暂存，最后置于液氮罐中长期保存。

1.3 MTT法观察细胞增殖并测定槲皮素对细胞增殖的影响

实验分为槲皮素处理组和DMSO对照组(含0.02%的DMSO)。将传代的HepG2及HepG2-X细胞培养板中的原培养基吸出，分别加入溶于DMEM培养基中的槲皮素，其终浓度为0(空白对照组)，10，20，40，80 μmol/L，每个浓度设 3 个复孔，分别培养24，48，72 h后，吸去孔内上清液，每孔加入150 μl的二甲亚砜，振摇溶解结晶后酶联免疫检测仪于595 nm波长处分别测定各孔吸光度(A)值，取其均数作为本次A值计数值。以时间为横轴，A值为纵轴绘制各组细胞生长曲线图，同样采用MTT法测定并计算细胞生长抑制率(IR)。IR=(对照组A值均数-实验组A值均数)/对照组A值均数×100% 。IR值越高，抑制作用越强。

1.4 细胞体外侵袭试验

Matrigel胶4℃过夜融化，与无血清RPMI1640培养基按1∶1 比例稀释，以 60 μl/孔在 Transwell上室进行铺胶，37℃放置于通风橱3 h使其成胶。经10，20，40，80 μmol/L 浓度的槲皮素处理细胞，胰蛋白酶消化，使细胞悬浮，经离心收集后用无血清RPMI1640 稀释成5 ×105个/ml，取200 μl细胞悬液加入Transwell上室中，下室加入500 μl含血清 RPMI1640培养液。常规条件下培养36 h，取出Transwell小室，用棉棒擦净未穿透微孔滤膜的上室细胞，PBS漂洗1次，4%的多聚甲醛固定30 min，PBS再次漂洗2次，Giemsa染色30 min，双蒸水冲洗。取下微孔滤膜，置于倒置显微镜下随机选择5个视野，计算基底膜下细胞，以穿膜细胞数表示细胞侵袭能力，每组设3个复孔，重复4次。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度槲皮素对细胞增殖的作用

MTT法检测各组细胞A值发现，HepG2-X细胞在24 h、48 h和72 h的A值均明显高于HepG2细胞(P＜0.05，见图1，2)，表明 HepG2-X 细胞生长速度明显加快，显示HBx对HepG2细胞具有促进增殖作用。各组中随着槲皮素浓度的增加，所测得的A值逐渐降低，与空白对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)，槲皮素处理组细胞增殖被明显抑制，随浓度的增加其抑制作用逐渐增强，槲皮素在浓度80 μmol/L时细胞增殖抑制最为明显;不同浓度的槲皮素处理组作用后抑制率(IR)随着时间的增加而升高，各组较前时间点差异具有统计学意义(P＜0.05，见表1，2)，且抑制作用与时间及浓度呈明显正相关。

图1 不同浓度槲皮素对HepG2-X细胞增作用的影响Figure 1 The inhibitory effect of different concentrations of quercetin on HepG2-X cells proliferation

表1 槲皮素对HepG2-X细胞作用不同时间的A值及生长抑制率Table 1 The absorbance and inhibitive rate of HepG2-X cells at different time after quercetin treatment

表2 槲皮素对HepG2细胞作用不同时间的A值及生长抑制率Table 2 The absorbance and inhibitive rate of HepG2cells at different time after quercetin treatment

2.2 槲皮素可抑制肝癌细胞的侵袭迁移的抑制

Transwell体外侵袭实验研究结果见图3，结果表明，HepG2细胞具有较强的侵袭能力，槲皮素处理36 h后，其侵袭能力明显减弱，与对照组迁移率100%相比，10，20，40，80 μmol/L 槲皮素处理组与空白对照组相比穿过滤膜的HepG2细胞明显减少，迁移细胞比率分别为91.82%，67.72%，48.20%，27.80%(P＜0.05);各处理组中不同浓度槲皮素作用后穿过滤膜的细胞数量随槲皮素浓度增加而减少。

3 讨论

槲皮素是一种天然黄酮类化合物，广泛分布于植物、食物及中草药之中。据报道，黄酮类化合物具有抗氧化、抗菌消炎、抗病毒、防癌、抗癌等作用［6］。我国每年约有11-13万人死于原发性肝癌，占全球肝癌死亡数的半数之多。在诱发肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的众多因素中，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染占到 50% 以上［7］。因此迫切需要寻找一种有效的临床治疗方法。槲皮素为黄酮类的一种，研究发现，槲皮素能有效抑制结肠癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌以及乳腺癌等多种肿瘤细胞的增殖和诱导肿瘤细胞凋亡［8-12］。本实验进一步探讨槲皮素对人肝癌HepG2细胞的影响，及HBx干预下对其影响，旨在为槲皮素应用于肝癌的临床治疗提供依据，以及将HBx作为肝癌基因治疗提供理论基础［13，14］。

图3 槲皮素对HepG2细胞侵袭能力的抑制Figure 3 Inhibitive effect of quercetin on the invasion of HepG2cells

本实验通过Transwell侵袭小室模型在体外进行肿瘤细胞侵袭能力检测，观察到HepG2细胞具有较强的侵袭能力，加入槲皮素后，其侵袭能力明显减弱，呈浓度依赖性，说明槲皮素可抑制肝癌细胞的侵袭能力。此外采用 MTT检测 HepG2-X细胞和HepG2细胞的增殖情况表明，槲皮素对两组细胞的生长活性具有抑制作用，其增殖抑制率与作用时间和剂量呈明显的相关性，随药物浓度增大作用时间延长，抑制率明显升高。以上结果表明，HBx可能促进肝细胞癌变或增强癌细胞的增殖及侵袭能力，槲皮素能够抑制肝癌细胞HepG2的增殖及侵袭力，作用机制还有待进一步研究。

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