新霉素发酵液提取工艺的优化研究

邱小明



新霉素发酵液提取工艺的优化研究

邱小明

（漳州职业技术学院 食品与生物工程系，福建 漳州 363000）

新霉素对热较敏感，现有提取工艺主要采用蒸发脱氨和浓缩，提取率仅达75％，残余的新霉素以废水方式排放，增加了污染物的排放。本研究通过工艺改进经732树脂动态吸附与洗脱，新霉素的交换量为142.9 mg•ml-1树脂，洗脱收率高于96％，同时减少了工艺水的用量。用LSA—700树脂脱色效果优异711树脂，新霉素回收率达92.1%，色素OD值为0.38。最后通过200Da 分子量的纳滤膜组件处理可有效去除物料中的NH4OH，新霉素的收率高于99.4％，副产物氨水可回收利用。优化后的新霉素提取率达88.2%，高于工厂现有水平，说明本工艺能够很好地应用于新霉素的提取。

新霉素；发酵液；提取；脱色；纳滤

微生物经发酵过程制得的发酵液中目的产物浓度较低,一般在10%以下[1]，有些甚至只有万分之几, 其余成分主要是水及细胞、代谢产物和未用完的培养基等[2]。微生物代谢过程产生较多的副产物，难以分离纯化，目前作为下游的生化分离和纯化手段往往步骤繁烦、处理时间长、收率低，严重地制约了新生物制品的产业化发展。生化分离纯化新技术的主要发展趋势是进行各种分离技术的优化集成，把两种以上的分离技术合成为一种更有效的分离技术，以达到提高产品收率、降低过程能耗和增加生产效益的目标。因此加强分离纯化新技术的集成研究，提高单元分离操作的效率，同时缩短整个下游过程的操作时间和流程，发展高效生物分离技术成为生物工程技术领域的一个重要研究课题[3]。

纳滤是近年来发展起来的一种介于超滤与反渗透之间的膜过滤方法，在制药行业中，纳滤膜可用于抗生素、维生素、氨基酸、酶等发酵液的澄清除菌过滤、蛋白剔除、分离与纯化；6-APA，7-APA，7ADC及其他半合成抗生素的脱盐浓缩等[4-5]。

新霉素对热较敏感，现有工艺主要采用蒸发工艺脱氨和浓缩，难以获得高的提取率，目前福州一医药有限公司新霉素的提取率仅达75％，残余的新霉素以废水方式排放，增加了污染物的排放量。因此迫切需要寻找一种有效的分离纯化方法来提高新霉素的提取率,降低污染物的排放。本研究采用离子交换技术结合膜分离技术等高效分离手段，提高了新霉素的提取率，降低了废水中新霉素的含量，达到了清洁生产的目的。

1 实验材料与方法

1.1 仪器及实验材料

PELambda Bio10紫外-可见光光度计（美国产）；

膜分离装置（厦门三达膜公司）;

Beckman Allegra64R高速离心机（美国Beckman公司）；

732（苯乙烯-二乙烯苯，磺酸基（-SO3H））离子交换树脂（上海华震）；

LSA—700树脂（上海华震）；

711、1300树脂（上海华震）；

OL1812C-47P 7885269和DK18120-47P 7885249纳滤膜（厦门三达膜公司）。

1.2 分析方法

新霉素效价测定采用OPA柱前衍生化法[6]，色素（OD）测定用分光光度计，在460nm下，以纯水作为参比，测定色素含量。

2 结果与讨论

2.1 提取工艺比较

2.1.1 现有工艺流程

福州一医药有限公司新霉素现有的提取工艺流程是将放罐发酵液加水稀释后直接与离子交换树脂混合，吸附提取有效成分，提取后的发酵液用水稀释后直接排放至污水处理车间（如图1）。由于发酵液中含有大量的不溶性花生饼粉、菌丝体、蛋白质和其他一些大分子等杂质，在吸附过程中这些杂质容易附着在树脂上，需要用数倍体积的水来漂洗吸附后的树脂，产生大量高浓度的废水。该提取工艺不仅对产品质量和提炼效果有较大的制约，而且对废水的治理带来了十分沉重的压力,增加了整个污水处理运行费用,不符合现代生物制药企业的清洁生产的要求[7]。

图1 现有工艺流程图

2.1.2 新工艺流程

本工作试图采用直接离心或过滤的手段对发酵液进行预处理，分离上清液和固形物，过滤所得的固形物可作为饲料出售，同时省去加水稀释和用水漂洗树脂的步骤，大大降低了水的耗用量。

图2 新工艺流程图

2.2 732离子交换树脂吸附与解吸

2.2.1 732离子交换树脂对新霉素静态吸附与动态吸附的比较

根据福州一医药有限公司现有情况，我们选用732离子交换树脂，采用静态和动态吸附方式测定新霉素发酵液的吸附量，考察这两种吸附方式对新霉素的吸附性能。

静态吸附：在室温下取湿树脂20ml置于200ml、19.4mg/ml离心后的新霉素发酵液中 ,用磁力搅拌器充分搅拌混合至交换平衡后，测定其残液浓度,计算出树脂的吸附量（平行做三次）。

动态吸附：在室温下取湿树脂50ml填装于1.6cm×45cm玻璃柱中，发酵液浓度为19.4 mg•ml-1、流速2 ml•min-1，上柱液总量为理论饱和交换量的三倍（一般强酸性树脂的理论饱和交换容量为150 mg•ml-1树脂）。所以用1500ml的发酵液上柱于强酸性树脂。交换完成后，测定其残液的浓度，计算出树脂的吸附量（平行做三次）。树脂静态和动态吸附结果见表1。

表1 732树脂静态和动态静态吸附结果比较

根据测定的静态吸附后残液浓度（6.25 mg•ml-1）说明732离子交换树脂静态吸附已经达到饱和。比较动态和静态吸附实验数据可以发现，动态吸附比静态吸附的交换量大，原因在于，动态吸附是种动态平衡过程，而静态吸附只是达到体系的整体平衡。在后续的实验中我们就选用动态吸附来研究新霉素的提取情况。同时在实验中我们还考察了流速和PH对动态吸附的影响发现差别不大，最后确定动态吸附的条件为流速2 ml•min-1、PH为发酵液PH（6.8-6.9）新霉素的吸附量为142.9 mg•ml-1树脂。

2.2.2 氨水浓度对洗脱结果的影响

经过上述动态吸附后的树脂，我们利用1%、2%、3%和4%四种浓度的氨水进行解吸洗脱，控制合适的洗脱条件（洗脱流速为2 ml•min-1），得到解吸液测定其效价，其得率结果见表2。

表2 不同浓度氨水解吸得率结果比较

实验结果表明3%、4%两种浓度的氨水的解吸效果基本相近，考虑到氨水的利用率，以及后续的纳滤操作，本实验确定3%的氨水为适宜的解吸液浓度，实验洗脱得率为96.3%，洗脱效果好。

2.3 新霉素洗脱液脱色研究

脱色是抗生素提取中的一个关键步骤，此步骤操作的好坏，不仅影响到下一步工序，更是关系到成品的色级等质量指标的好坏。目前生产上多采用711树脂脱色，但711树脂的运转周期短，容易中毒失效，继而影响成品的质量。本实验采用了一种新的脱色树脂LSA-700，并以711和1300树脂进行对照实验。

2.3.1 树脂预处理

吉林省出台的《关于加强孤儿保障工作的实施意见》中规定：加强孤儿成年后就业扶持。按规定落实好社会保险补贴、岗位补贴等扶持政策，及时将成年后就业困难且符合条件的孤儿纳入就业援助范围，有针对性地提供就业帮扶。孤儿成年后自主创业的，按优于大学生自主创业的条件，享受创业税收优惠，需贷款扶持的，优先享受小额担保贷款。拓宽孤儿成年后就业渠道。在开发公益性岗位时，对成年后就业困难或参军复员的孤儿，优先安排其到政府开发的公益性岗位就业。在实施高校毕业生到社区、村任职选聘工作中，优先录用符合条件的孤儿。参军复员的孤儿，优先安排工作。

取LSA—700树脂100ml，装入交换柱中（3cm×14cm）。分别用4%的NaOH和HCl洗脱，然后水洗至pH6.5～7.0；转型时再用4%的NaOH以4ml•min-1的流速通过树脂层，通过量约400ml，水洗至pH<9，再投入使用。711和1300树脂也进行相同的处理和装柱。

2.3.2 脱色处理

将处理好的LSA—700树脂、711和1300树脂各100ml分别装柱（平行试验各3次），将732饱和树脂解吸液(浓度137.7 mg•ml-1)的洗脱液1000ml上柱,上柱流速为2ml•min-1,过柱脱色,用三倍体积的去离子水洗涤，分别用HPLC和分光值检测新霉素的回收率和色素OD值[8]（Ev），结果见表3。

表3 几种不同树脂脱色效果比较

由上表分析可知，LSA—700树脂的脱色性能明显优于711和1300树脂，洗脱回收率达92.1%色素OD值为0.38，在后续实验中我们选择LSA—700来进行实验。

2.4 脱氨与浓缩

经过脱色的解吸液中含有高浓度的氨，且解吸液中新霉素浓度不高，需要进行脱氨和浓缩。目前工业化生产工艺中结晶前物料的浓缩采用薄膜蒸发技术，由于新霉素的热稳定性低，无法提高浓缩倍数，导致结晶效率低，大量抗生素随母液排放，构成生产过程中的第二大污染源。

由于纳滤膜对分子量200-2000 Da之间的有机物具有很强的截留率，而对小分子的截留率低，因而在压力驱动下可以很快地实现对低分子有机物的纯化、浓缩和水中高价离子的去除。根据新霉素的分子量（774），本实验通过试验比较最后采用厦门三达公司的1810型纳滤设备进行脱氨和浓缩，在实验中选用OL1812C-47P 7885269和DK18120-47P 7885249两种纳滤膜（膜的截留分子量分别为250Da和200Da）来进行脱氨和浓缩研究。

2.4.1 250Da和200Da两种膜组件纳滤脱氨性能的比较

取脱色液5L（新霉素含量126.8 mg•ml-1、pH 10.5 、NH4OH浓度3%），启动纳滤装置，操作压力2.5MPa，温度30℃。实验过程中每5min测定回流罐中浓缩液的pH值。待回流罐中浓缩液体小于1.5L时，加水4L，重复操作。结果见表4。

表4 不同截留分子量膜组件纳滤脱氨效果比较

从上表可以看出，虽然250 Da纳滤膜的脱氨速度较快，90min后就后PH值就降到9.20，但新霉素损失率较高（达12.5%），对比结果我们选择200Da纳滤膜进行脱氨浓缩处理的后续研究。

2.4.2 200Da膜脱氨效果的研究

实验表明，pH随着处理时间的延长基本上是匀速降低，速度约为每5min降低0.05单位（如图3）。氨水浓度的高低对于脱氨效率和脱氨时间的长短并无太大的影响。说明分子量200Da 的DK18120-47P 7885249膜组件能够很好地除去洗脱液中的氨。

2.4.3 浓缩效果的研究

本工作考察了纳滤装置能够进行多大程度的浓缩以及所需浓缩时间的长短。实验结果如图4。

从图4可看出，在15～35min期间浓缩液的效价上升最快，到后期35min以后，由于浓缩液浓度较大，导致流通量减小，使得浓缩速度降低。在本实验中，约4×104 u•ml-1的物料经40min处理可浓缩4倍，含新霉素16×104 u•ml-1的物料就可以直接用于喷雾干燥。说明纳滤装置能较好地满足新霉素浓缩的需要。

图3 3%氨水脱氨效果

图4 200Da卷式膜浓缩效果

2.4.4 膜的流通量变化情况

随着料液的不断循环，料液浓度增加必然会影响到纳滤膜的流通性能，本实验考察了流通量的变化情况以及这种变化是否具有可逆性，结果如图5所示。

图5 200Da纳滤膜的流通量变化

在浓缩过程中，随着操作时间的延长,膜上新霉素的浓度不断增加,浓差极化也随之严重,同时由于料液浓度的增加，导致纳滤膜的流通量会显著降低，在30min后流通量由开始的250ml/min下降到50ml/min,但加入4L水对料液进行稀释后，膜的流通速率迅速恢复到原有水平。说明这一过程是可逆，本实验中未观察到纳滤膜的流通堵塞现象,说明该方法能够很好地用于新霉素的脱氨和浓缩。

2.5 新霉素的总回收率计算

3 结论

1.本工作研究了新霉素的新型提取纯化技术，对3个重要单元操作过程进行了优化。新的技术集成（动态732树脂吸附àLSA—700树脂脱色à200Da纳滤膜处理）有利于提高新霉素的提取率和降低污染物的排放量。

2.采用压滤方法对发酵液进行预处理，滤液再用732树脂动态吸附和动态洗脱，新霉素的交换量可以达到142.9 mg•ml-1树脂，洗脱收率高于96％，同时大大减少了工艺水的用量。LSA—700树脂脱色比原来711脱色效果更好，洗脱回收率达92.1%色素OD值为0.38。

3.分子量200Da 的DK18120-47P 7885249纳滤膜处理可有效地去除物料中的NH4OH，同时可有效地脱水浓缩，经浓缩的物料可直接用于喷雾干燥或用于结晶。纳滤操作中新霉素的收率高于99.4％，副产物氨水可回收利用。

4.优化后的提取工艺新霉素提取率达88.2%，高于原来工厂的75%，说明本方法能够很好地应用于新霉素发酵液的提取。

[1] 李艳.发酵工业概论[M].北京:中国轻工业出版社,1999:204-266.

[2] 张月萍,赵平,焦运伏,等.膜分离技术及其在发酵液后处理中的应用[J].河北科技大学学报,2002,23(3):21-25.

[3] 周加祥,刘铮.生物分离技术与过程研究进展[J].化工进展,2000(6):38-40.

[4] 何毅,李光明,苏鹤祥,等.钠滤膜分离技术的研究进展[J].过滤与分离,2003,13(3):5-7.

[5] 王晓琳,张澄洪,赵杰.钠滤的分离机理及其在食品和医药行业中的应用[J].膜科学与技术,2000,20(1):29.

[6] 李峰,邱小明,石贤爱,等.OPA柱前衍生法测定硫酸新霉素的含量[J].福州大学学报:自然科学版,2007,35(1):130-132.

[7] 石贤爱,李聪颖,陈飞,等.清洁生产驱动的弗氏链霉菌新霉素发酵过程优化策略[J].福州大学学报:自然科学版,2010,38(1):147-152.

[8] 胡博涵,刘素纯,何理,等.产紫红色素菌株的筛选及诱变[J].食品与机械,2011(3):29-31.

Studies on optimization of neomycin fermentation liquid extraction process

QIU Xiao-ming

（Foods and biology engineering department, Zhangzhou Institute of Technology,Fujian Zhangzhou 363000，China）

Because neomycin is sensitive to heat, the extraction rate of the existing extraction technology by applying the evaporation deamination and concentration is only 75%. The residual neomycin is discharged as wastewater increasing pollutant discharge. Through the improved process using dynamic adsorption and elution of 732 resin in this study, the exchange capacity of neomycin is 142.9 mg per ml resin, the elution yield is higher than 96%, while reducing water consumption. The decoloration effect of LSA - 700 resin is better than 711 resin, whose neomycin recovery rate reaches 92.1% and pigment OD value is 0.38. Finally, the NH4OH in materials can be effectively removed by nanofiltration membrane of 200Da, the neomycin yield is higher than 99.4%, and the by-product ammonia can be recycled. After the optimization, the neomycin extraction rate is 88.2%, higher than the existing level, showing this process can be well applied to neomycin extraction.

Neomycin；fermentation liquid；extraction；Nanofiltration

TQ465

A

1673-1417（2013）01-0021-06

2012－12－20

漳州职业技术学院科技资助项目(ZZY113)

邱小明（1979－），男，江西赣州人，讲师，硕士研究生，研究方向：生物化工与生物制药工程

（责任编辑：季 平）