辅助生殖技术中低氧浓度胚胎培养的meta分析

牛子儒 岳晓静 孔群钰 王元芬 侯彩英 姚元庆

1.中国人民解放军总医院妇产科(北京，100853);2.复旦大学卫生统计学教研室;3.中国人民解放军第二炮兵清河门诊部

在人类辅助生殖技术中，特别是体外受精(IVF)和卵泡浆内单精子注射(ICSI)，从受精卵到胚胎都需要在体外环境中培养。在体内，胚胎早期周围环境的氧浓度为2% ～8%［1～3］，但大多数IVF实验室都在大气常氧浓度(20%)下培养胚胎。低氧浓度培养的优势还未明确，并且需要更多的花费，不仅需要特殊的3种气体培养箱，还需要氮气来维持低氧浓度。最近在小鼠、牛胚胎以及人胚胎干细胞和拟胚体的研究中发现，大气氧浓度培养不利于胚胎发育和有关基因的表达［4～6］。目前对于低氧浓度对IVF/ICSI结局的影响尚无统一定论。2011年Gomes Sobrinho等［7］的meta分析共纳入了7个相关研究，分析胚胎受精率、妊娠结局后认为没有证据证明低氧浓度是必需的。2012年来自Cochrane协作网的Bontekoe等［8］的系统综述同样纳入了7个研究，通过分析显示低氧浓度可以提高IVF的出生率，但其纳入的研究方法学质量较低，仍需更多的高质量研究来证实。本研究收录相关随机对照试验(RCTs)，meta分析胚胎低氧浓度培养对胚胎发育及临床结局的影响等，为其临床效果和安全性提供评价依据。

1 资料与方法

1.1 纳入与排除标准

纳入标准:①研究类型为RCTs;②研究对象为IVF/ICSI体外培养胚胎;③研究对象分为两组:低氧组为应用低氧浓度(5%)培养箱培养胚胎，应用大气氧浓度培养胚胎的常氧组做为对照组;④基线数值与数值变动情况需描述完整;⑤结局指标包括受精率、种植率、妊娠率、流产率。排除标准:①不符合纳入标准;②随访期或失访人数不明确;③重复发表;④文献质量过低(Jadad评分＜3分)。

1.2 检索策略

计算机检索数据库:PubMed、Ebase、Cochrane Database、中国知网、万方数据库、中国生物医学文献服务系统。中文检索词采用“胚胎培养”、“氧浓度”，英文检索采用Cochrane检索策略收集文献，并辅助手工检索和google学术网络搜索，末次查询为2013年1月6日。

1.3 资料提取

两名研究人员独立阅读标题和摘要进行文献筛选，对可能符合纳入标准的文献阅读全文，对可纳入的研究进行审查和数据提取，如有争议或分歧，讨论或由第三位评价者决定是否纳入。

1.4 研究质量评价

文献质量依照Cochrane协作网推荐的“偏倚风险评估”工具，主要包括6个方面:①随机分配方法;②分配方案隐藏;③是否采用盲法;④结果数据的完整性;⑤选择性报告研究结果;⑥其他偏倚来源。针对每一项研究结果，对上述6条做出“是”(低度偏倚)、“否”(高度偏倚)和“不清楚”(缺乏相关信息或偏倚情况不确定)的判断。两位研究者交叉评价纳入研究的质量，有分歧或难以确定的评价通过讨论或第三位评价者协助解决。

1.5 统计分析

结果指标为分类变量和数值变量。固定模型计算分类变量比值比(OR)和95%可信区间(95%CI)(Mantel-Haenszel方法)，95%CI为:exp［ln(OR)±1.96×SE(lnOR)］，SE为 OR的标准误;数值变量采用加权均数差(WMD)或标准化均数差(SMD)。均数为基线数值与干预后对应值之差，标准差采用S:分别为干预前、后标准差)计算。不同效应指标异质性检验采用χ2检验结合I2统计量，检验P＜0．05或I2＞50%采用D-L法随机效应模型分析，反之采用固定效应模型。发表偏倚采用Eegg＇s直线回归法，对存在偏倚的研究排除后再进行分析。以上使用Rev-Man5.1软件进行统计分析。

2 结果

2.1 纳入研究及质量评价

计算机检索292篇相关文献，按照纳入、排除标准最终纳入10篇文献，合计研究例数5 520例。8篇英文文献分别来自瑞典、美国、荷兰、西班牙和韩国等。入选文献的一般情况见表1，全部研究均报道了基线情况及可比性，采取随机分配，并对失访情况进行描述。偏倚风险评价，8篇研究采用正确随机方法，2篇研究随机方法不明确;全部研究均提及分配方案隐藏;虽仅有一篇研究采用盲法，但结果判断和测量为客观指标，不受影响;各研究组间缺失的人数和原因相似;所有研究的期望结局指标，包括在发表文献中预先指定的指标均有报告;纳入研究无其他偏倚来源。综上，可认为入选研究属于较高质量。

表1 meta分析纳入文献的基本情况

2.2 评价结果

2.2.1 种植率 对纳入种植率meta分析的6篇研究进行异质性检验 (χ2=9．82，P=0．08，I2=49.0%)，可认为这些研究具有同质性，使用固定效应模型计算合并统计量。OR值的合并效应量为1.16，95%CI为1.05～1.29。合并效应量的检验(Z=2.82，P=0.005)，差异具有统计学意义，可认为低氧浓度培养的胚胎种植率高于常氧浓度培养。meta分析森林图见图1。

图1 种植率比较的森林图

2.2.2 继续妊娠率 对6篇报告继续妊娠率的研究进行异质性检验(χ2=4．91，P=0．43，I2=0.0%)，使用固定效应模型计算合并统计量。OR值的合并效应量为1．32，其95%CI为1.12～1.55。合并效应量的检验(Z=3．34，P＜0.01)，差异具有统计学意义，可认为低氧浓度与常氧浓度培养在继续妊娠率上有差异。由于各研究胚胎移植日不同，分别对取卵后第3天(D3)和第5天(D5)进行亚组分析。共5篇研究纳入D3亚组进行异质性检验(χ2=4.59，P=0．33，I2=13.0%)，使用固定效应模型计算合并统计量。OR值的合并效应量为1．35，其95%CI为1.11～1.64。合并效应量的检验(Z=3.00，P=0.00)差异具有统计学意义，可认为低氧浓度与常氧浓度对D3移植胚胎继续妊娠率的影响有差异。仅一篇研究报告D5移植的胚胎继续妊娠率。meta分析森林图见图2。

2.2.3 临床妊娠率 对7篇报告有临床妊娠率的研究进行异质性检验(χ2=10．92，P=0.09，I2=45%)，可使用固定效应模型计算合并统计量，OR值的合并效应量为1.28，其95%CI为1.07～1.53，合并效应量的检验(Z=0.66，P=0.01)，差异具有统计学意义，可认为低氧浓度培养的临床妊娠率优于常氧浓度培养。对D3和D5分别进行亚组分析，4篇研究进入D3亚组，异质性检验(χ2=1.63，P=0.65，I2=0%)，可使用固定效应模型计算合并统计量。OR值的合并效应量为1.33，其95%CI为1.07～1.65，合并效应量的检验(Z=2.53，P=0.01)，差异具有统计学意义，认为对D3移植胚胎低氧浓度培养可提高其临床妊娠率。2篇研究进入D5亚组，异质性检验(χ2=0.47，P=0.49，I2=0%)，可使用固定效应模型计算合并统计量。OR值的合并效应量为1.67，其95%CI为1.19～2.35，合并效应量的检验(Z=2.98，P=0.00)，差异具有统计学意义，可认为对D5移植胚胎进行低氧浓度培养亦可提高其临床妊娠率。meta分析森林图见图3。

2.2.4 多胎妊娠率 对报告有多胎妊娠率的6篇研究进行异质性检验(χ2=5．87，P=0．32，I2=15%)，可使用固定效应模型计算合并统计量，OR值的合并效应量为 1．14，其95%CI为0．88 ～1．47，合并效应量的检验(Z=0．99，P=0.32)，差异不具统计学意义，尚不能认为两组在多胎妊娠方面有差异。meta分析森林图见图4。

图4 多胎妊娠率比较的森林图

2.3.4 流产率 对报告有流产率的3篇研究进行异质性检验(χ2=0．43，P=0．81，I2=0%)，可使用固定效应模型计算合并统计量，OR值的合并效应量为0．98，其95%CI为0．63 ～1．53，合并效应量的检验(Z=0．09，P=0.93)，差异不具统计学意义，尚不能认为两组的流产率有差异。meta分析森林图见图5。

图5 流产率比较的森林图

3 讨论

本次meta分析主要研究了胚胎体外培养氧浓度对于临床结局的影响，通过系统地查阅文献，严格纳入和排除标准，共纳入10个 RCTs，调查对象5 520例，均为高质量研究。在文献筛选阶段，有些国外高质量的研究因不能获得其准确的数据而排除，研究纳入可能存在一定偏倚，应该客观谨慎地看待本次分析结果。

本次meta分析显示了低氧浓度培养的胚胎在种植率、继续妊娠率和临床妊娠率3方面均高于常氧浓度培养。关于临床妊娠率的亚组分析显示，低氧培养D5移植的胚胎较D3移植的胚胎更有优势。这可能是由于在囊胚期阶段低氧浓度的培养更利于胚胎发育和着床。但由于纳入的研究有限，仍需大样本的多中心随机对照试验进一步验证分析。本meta分析并未找到有关证据显示低氧浓度与常氧浓度培养的胚胎在多胎妊娠率和流产率方面有差异，尚不能认为低氧浓度培养会增加多胎妊娠或流产的风险。

已有很多动物实验证明，低氧培养在胚胎形成晚期(囊胚期)及胎儿发育期有一定优势［19～23］，这些研究提示应在囊胚培养阶段降低氧浓度。体内的胚胎一直暴露于低氧的环境中，从未暴露于20%的氧浓度环境，而这一氧环境被很多学者认为可以产生活性氧(ROS)。过高的ROS可以导致DNA的损伤、线粒体的改变、脂质过氧化或者蛋白质的氧化改变等［1，24，25］。有研究显示高氧环境可以改变胚胎的发育潜能［26］。在一些动物研究中发现了高氧环境的不利影响，如在小鼠实验中，低氧与高氧培养的胚胎桑葚胚和囊胚的发生率及形态学虽然无差异，但低氧培养的胚胎内细胞团数目和着床率显著高于正常氧浓度组［19］。实际上最近有研究显示低氧浓度培养胚胎可以显著提高胚胎质量、种植率、妊娠率及出生率［27］。

胚胎在早期阶段暴露于高氧浓度环境可能会对胚胎后期产生一定的负面影响，从而影响临床结局［19，28］。Nanassy等［29］研究显示在 D1 ～ 2 时应用常氧浓度培养胚胎，在D3～5时应用低氧浓度培养，与一直于常氧浓度培养胚胎相比，并未提高其种植率、妊娠率或囊胚形成率。该研究认为虽然在胚胎发育后期应用低氧浓度培养胚胎，但无法弥补早期高氧浓度造成的损害。但在D2～3移植胚胎的相关氧浓度研究中也未发现低氧浓度有显著的益处［1］，目前这些研究都只关注于形态学和着床情况，今后的研究可以更多关注其他的潜能指标，比如氧浓度导致基因表达的改变［30］。培养小鼠胚胎在Whitten培养液时基因H19的缺失低于在KSOM+AA培养液［31］。另一研究结果显示，在培养液中加入血清可以影响印记基因的表达［32］。这些为将来的氧浓度研究提供了一些可以参考的检验指标。

从目前的结果可以认为低氧浓度培养胚胎可以在一定程度上提高妊娠率，并且不增加多胎妊娠及流产的风险。但进一步的确切结果仍有待于更多大规模、长期、多中心的随机对照研究，纳入系统综述，进行累计meta分析，以更加明确低氧浓度培养对胚胎发育及临床结局的影响和安全性。

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