亚细胞蛋白质组研究进展

孔汉金，张克山，刘永杰，尚佑军，吴 斌，刘湘涛＊

（1.中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，国家口蹄疫参考实验室，甘肃兰州730046；2.华中农业大学动物医学院 农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉430070）

差异蛋白质组学被认为是了解细胞功能和疾病发生过程的关键。比较不同生理或病理条件下蛋白质组差异表达，鉴定和分析差异蛋白对细胞代谢的影响有助于揭示细胞的生理机能及疾病致病机理。依据各个细胞成份在空间结构、功能和分布的不同，可将其划分为不同的细胞区域或功能相关的蛋白复合体。目前，大多数蛋白组研究者以亚细胞蛋白质组作为切入点，即先通过研究亚细胞蛋白质组学，进而将各亚细胞结构蛋白组进行整合分析，从而获得对全细胞蛋白质组的整体认识。亚细胞蛋白质组主要对亚细胞区室、细胞器、大分子结构和多蛋白复合物所包含的蛋白质进行研究分析，明确不同状态下蛋白质组表达情况对亚细胞功能联系的重大意义。本文就近年来亚细胞蛋白质组研究概况做一综述，并对研究结果所揭示的生物学意义进行了讨论分析。

1 亚细胞蛋白组的分离及纯化

亚细胞结构的提取和纯化是亚细胞蛋白质组研究的基础。蛋白常规差速离心结合密度梯度沉降分离方法应用较为广泛，其原理是根据不同亚细胞组分的密度和沉降系数来分离亚细胞组分。分离的先后顺序依次为细胞核，线粒体，溶酶体与过氧化物酶体，内质网与高尔基体，最后为核糖体。细胞核与线粒体密度差异显著，利用离心方法分离效果明显，但其他细胞器间大小、密度相互重叠，密度梯度沉降时不同组分相互混合，难以达到完全分离的目的。相继出现的分步抽提法，电泳分离法（高效密度梯度电泳和免疫自由流电泳）、免疫亲和法、流式细胞法、双向系统法和亲和纯化－免疫磁珠纯化分离等方法极大地提高了不同细胞器的分离效率，并且某些分离方法能够有效提取不同的亚细胞组分。Herrnstadt C等［1］利用免疫磁珠分离纯化法分离到高纯度的线粒体，后来该分离方法得到了广泛应用，高尔基体、过氧化物酶体、囊泡等亚细胞结构也相继被分离纯化。有时对于密度相近的细胞器，可通过与其他介质混合使其密度间有显著差异。例如，在提取质膜亚细胞组分时，可用阳离子硅胶包被质膜，使其与其他细胞器密度差异明显，然后通过密度梯度离心使细胞质膜得到高度纯化。Abdolzade－Bavil A等［2］研制出基于微分洗涤剂分馏分离方法（DDF）的蛋白提取试剂盒，分离的亚细胞蛋白组分经2－D电泳，形态学、免疫学和酶促反应分析显示出具有较高的效率和选择性。用此方法提取保存多年的冰冻组织中的亚细胞结构组分，结果发现蛋白组覆盖率和蛋白定位信息几乎没有损失。也有人报道了利用洋地黄皂苷和去垢剂从培养的哺乳动物细胞液中分别提取浓缩到细胞质基质，胞膜和核以及一些不溶性蛋白，经后续试验验证提取效果较好。Kislinger T等［3］结合亚细胞器分离技术以及基于鸟枪测序的串联质谱技术检测实验小鼠不同组织的4个主要细胞器蛋白含量，利用严格的统计筛选和机器识别方法，共鉴定到4 768种蛋白，其中3 274种蛋白得到确切的亚细胞定位，包括1 503种未知特征蛋白，然而通过比较之前报道的mRNA表达模式评估了这些蛋白的组织选择性。该成果可为主要动物模型的组织和器官表达蛋白组提供可靠的参考。亚细胞结构的生物学特性决定了单独使用一种分离方法分离不同亚细胞器蛋白质组效果往往不理想，亚细胞结构的分离纯化仍然是亚细胞蛋白组学研究的一大挑战。

对分离的亚细胞蛋白组分进行纯度鉴定是亚细胞蛋白质组学研究必不可少的步骤，通常结合形态学和生化方法验证提取蛋白的纯度。目前，进行纯度评价的方法包括利用电子显微镜观察亚细胞结构，明确是否有其他组分污染；利用Western blot方法测定目的细胞器标志酶含量和可疑污染细胞器的标志酶含量，两者的比值即为目的细胞器相对于整个匀浆液中的富集程度；利用特异性抗体检测细胞器中特异性蛋白从而评价亚细胞成分的纯度。Foster L J等［4］通过对肝脏细胞分离的亚细胞组分标记酶或标记蛋白的鉴定分析，验证了分离的蛋白组分别来之于相应的10个不同亚细胞器。近年来，Andreyev A Y等［5］从 RAW264.7细胞中提取6种亚细胞组分（细胞核，线粒体，细胞质、内质网、质膜和微粒体），通过定量LC－MS蛋白组学技术鉴定了50种各细胞器的标记酶来评价各亚细胞组分分离的纯度。

2 亚细胞蛋白质组

2.1 细胞膜

细胞膜含有特定的蛋白受体，成为药物设计的靶标，现已知细胞膜蛋白占整个药物靶标的70%左右。细胞膜蛋白因其具有两性特征而难以提取、溶解和分离。可首选用甲醇与碳酸氢氨抽提跨膜蛋白后再加入生物素标记的半胱氨酸对膜蛋白进行亲和纯化，可有效抽提膜蛋白。蛋白组学技术的发展促进了细胞膜表达蛋白组的研究。Han C L等［6］应用凝胶辅助消化法结合iTRAQ标签的定量蛋白质组学技术定量膜蛋白，共鉴定到520种膜蛋白，该法能从提取膜组分的19个TM螺旋的完整膜蛋白中检测到跨膜肽段（TM）。细胞膜上含有疾病相关生物标记物，利用蛋白组学技术对细胞膜蛋白进行分析，可找出疾病相关膜靶蛋白。Oh P等［7］对正常和患乳腺癌大鼠的肺泡上皮细胞的细胞膜进行了差异蛋白组学分析，发现12种差异蛋白在肿瘤肺泡上皮细胞膜表达上调，后来将抗膜联蛋白A1抗体注射到肿瘤大鼠后发现患病大鼠肿瘤发生了迁移，此项研究表明膜联蛋白A1为肿瘤标记物。近几年利用亚细胞蛋白组学技术寻找人类癌症相关生物标记物众多研究报道中，提取细胞膜等亚细胞组分常作为必须考虑的研究对象。为鉴定与人类肝癌相关的有意义蛋白标记物，Lee Y Y等［8］提取肝癌细胞的细胞膜、胞质、核和细胞骨架等亚细胞组分，利用凝胶电泳结合液相色谱分离－质谱联用技术共鉴定到3 045个差异蛋白点，用PLGEM统计分析法区分差异表达蛋白发现有21个蛋白可能与肝癌有关。通过进一步的Western blot、免疫荧光分析和免疫组化方法证实HCC、MATR3、LETM1、ILF2和IQGAP2等5种蛋白与肝细胞癌变过程有关，可作为肝癌细胞的分子标记物。Burong L等［9］提取人类肺肿瘤和周围正常肺组织细胞膜蛋白进行2－D电泳分离，经MALDI－TOF－MS分析，鉴定了19个差异蛋白点，其中12个蛋白上调，7个蛋白下调，再经RTPCR与Western blot验证了下调蛋白CTSD和上调蛋白HSP60，生物信息学分析推测这2个蛋白可作为诊断和治疗肺癌以及解释其致病机理的生物候选标记。随着更多的细胞膜蛋白质组数据库的建立，将有更多的疾病相关生物标记物被发现。

2.2 线粒体

线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，有细胞“动力工厂”之称。根据人类基因组序列估计线粒体蛋白大约有1 000～2 000种，已有700多种线粒体蛋白得到鉴定，其中只有13种线粒体蛋白是由线粒体自身DNA编码。研究者构建了许多不同物种线粒体蛋白表达谱和描述线粒体蛋白分类，功能及相互作用的数据库［10］。早前有人报道利用蛋白组学技术建立的人类胎盘组织线粒体蛋白质表达图谱，只鉴定出46种蛋白。后来Taylor S W等［11］采用SDS－PAGE分离人心肌线粒体蛋白后进行蛋白组学分析，共鉴定出615种蛋白，其中与氧化磷酸化相关蛋白占90%以上。对线粒体进行大规模的蛋白组学分析可以获得多种蛋白变化信息从而有助于揭示线粒体代谢紊乱疾病的致病机理。Spahr C S等［12］采用苍术苷隔离线粒体引起转运孔复合物（PTPC）开放，结果鉴定出79种已知蛋白，其中21种蛋白与人表达序列标签（EST）相配，还发现其中一些蛋白质与细胞凋亡相关。Palmfeldt J等［13］等为揭示乙基丙二酸脑病（EE）的致病机制，从EE患者的皮肤成纤维细胞提取线粒体与正常皮肤作蛋白组学分析，发现有7个线粒体蛋白差异表达显著，其中乙醛脱氢酶X（ALDH1B）和细胞凋亡因子（AIFM1）与细胞解毒机能和凋亡有关。Chen Y J等［14］鉴定了胰腺肿瘤组织中与肿瘤生长相关的线粒体蛋白L28（MRPL28）和L12（MRPL12），经后续试验发现这些蛋白能降低线粒体活力，增加糖酵解，体外抑制细胞成长，体内促进细胞生长，进而推测非原癌基因突变引起的线粒体代谢改变可能是调控肿瘤细胞耗氧量的重要机制。Roxo－Rosa M等［15］比较正常人与鼻囊性纤维化病人（CF）的鼻细胞线粒体蛋白组学变化，发现与机体慢性炎症和氧化应激损伤的蛋白差异表达显著，而线粒体蛋白的低水平表达表明CF鼻细胞线粒体代谢发生了改变。

2.3 内质网

内质网的主要功能是参与蛋白质合成、修饰与加工、新生肽链的折叠、组装和运输，还具有合成膜脂、调节血糖和钙离子浓度的作用。对亚细胞器的结构蛋白组学研究能获得相应蛋白质复合物的生化和细胞功能信息。Knoblach B等［16］对小鼠肝脏内质网进行蛋白组学分析，结果鉴定了141个蛋白斑点，其中6个未知蛋白，新发现的2种蛋白命名为ERp19和ERp46，氨基酸序列分析表明ERp19和ERp46分别含有1个和3个硫氧还原序列，为硫氧还原蛋白家族成员，随后的Western blot和Northern blot试验表明，与其他组织比较，肝脏中这2种蛋白和其相应的mRNA表达水平均上调，亚细胞定位显示这2种蛋白都富集于肝脏内质网囊泡内，利用酵母遗传互补试验结果发现ERp46具有PD（二硫化物异构酶）功能，而ERp19则没有。为明确生理与病理状态下胰腺内质网的蛋白组学情况，Chen X等［17］利用iTRAQ 标签结合2DLC－MALDI－MS／MS蛋白组学技术定量比较患急性胰腺炎（AP）和正常大鼠胰腺中粗面内质网的蛋白组学变化，共鉴定到469个差异蛋白点，这些蛋白归类于核糖体蛋白，易位子，分子伴侣，分泌性蛋白和脂质酶类。共有37种表达显著差异的粗面内质网蛋白包括消化酶类和翻译调节因子，在细胞凋亡过程中具有重要生物学意义，而分子伴侣蛋白则变化轻微，进一步的分析发现急性胰腺炎中Erp27、甘油三酯脂肪酶前体、和脯氨酰4－羟化酶3种蛋白表达下调，纤维蛋白原α、β和γ链表达显著上调，这些结果表明细胞凋亡早期其粗面内质网蛋白变化可能影响消化酶的合成与加工。

2.4 高尔基体

高尔基体是由许多扁平囊泡构成，其功能是将内质网合成的蛋白质进行加工，修饰，分类并呈送到细胞特定部位或分泌到细胞外。同时高尔基体也参与细胞内信号传导，在细胞凋亡过程中扮演重要角色。根据人基因组序列预计有1 000种高尔基体蛋白，但只有200种蛋白得到鉴定。关于哺乳动物高尔基体表达蛋白组学研究能够鉴定出亚细胞组分中新的蛋白质。Bell A W 等［18］采用 TritonX－114对纯化的鼠肝脏高尔基体蛋白分级后经SDS－PAGE分离，再经PMF和MS／MS分析共鉴定出81个蛋白，其中49个为含有跨膜区的整合膜蛋白，鉴定出的蛋白以高尔基驻留蛋白和膜转运蛋白为主；此外还发现分子质量为34ku新的高尔基体相关蛋白质GPP34，该蛋白随后被研究者广泛研究并作为高尔基体转运蛋白家族的新成员。此外Wu C C等［19］对大鼠不同状态下乳腺上皮细胞高尔基体进行蛋白组学分析，发现大鼠处于最大分泌时30种蛋白表达上调，这些上调蛋白属于调控蛋白，转运蛋白和信号传导蛋白类。许多关于高尔基体的蛋白组学研究揭示了高尔基体具有精氨酸甲基化功能，后来Wu等对大鼠高尔基体进一步分析，利用MudTIP技术共鉴定了421个蛋白质，其中一个推测为甲基转移酶，进一步分析发现在高尔基体中有18个蛋白质是精氨酸二甲基化的；接着Wu等又设计甲基化活性试验进行了验证，他们用甲硫氨酸和Triton－100溶液孵育高尔基体蛋白质，经质谱鉴定出3种甲基化蛋白。对不同生物体及不同生理、病理状态高尔基体的蛋白质组学研究将会进一步加深对高尔基体结构和功能的认识。Chen X等［20］为发现子代高尔基体合成需要细胞分裂时母代高尔基体分解和重新装配的内在分子机制，采用iTRAQ标签的定量蛋白组学技术检测和分析大鼠有丝分裂间期和分裂期高尔基体膜的差异蛋白组，共有1193个蛋白点得到鉴定，这些蛋白归类于高尔基体结构蛋白、高尔基体驻留酶、SNAREs、Rab GTPases和细胞骨架蛋白；有86个蛋白经Western blot验证在有丝分裂间期和分裂期表达差异显著且有生物学意义，推测这些蛋白与细胞周期高尔基体的分解和从新装配有关。随着亚细胞器分离技术和纯化技术的发展，对不同生物体及不同生理、病理状态高尔基体的蛋白质组学研究将会进一步促进对高尔基体结构和功能的认识。

2.5 细胞核

细胞核是遗传物质储存和复制的场所，是细胞遗传性和代谢活动的控制中心，在细胞的代谢、生长和分化中起着重要作用。Schirmer E C等［21］提取肝脏的核膜蛋白利用差减蛋白组学技术共鉴定了80个蛋白质，其中13个为已知核膜蛋白，67个为新蛋白，通过免疫定位试验发现其中8个定位于核膜，其余59个蛋白尚需进一步的功能和定位分析。对核孔复合体蛋白质组成分析有利于对其转运机制的认识。Rout M P［22］等借助不同缓冲体系和蔗糖密度梯度离心分离到高纯度的酵母核孔复合体蛋白，经鉴定得到174个蛋白，其中34个未知蛋白质，这些未知蛋白的发现对于研究核孔复合体在核内物质转运的作用有重大意义。目前很多动物遗传疾病与核膜和核孔复合物的结构异常有关，核膜与核孔复合物联系紧密。对核膜的比较蛋白组学研究发现鉴定到很多蛋白具有明显的序列特性，而且这些蛋白质对于核孔复合物行使其功能具有一定作用，特别是核膜组分富集的蛋白质中含有苯丙氨酸－甘氨酸重复序列影响着核转运功能［23］。利用蛋白组学技术寻找和鉴定与细胞核相关的疾病生物标记物也得到了广泛研究。McKinney K Q等［24］等对人的胰腺癌细胞和正常胰腺细胞核进行了差异蛋白组学分析，共鉴定到2393个差异蛋白点，利用PLGEM统计分析有104个蛋白与胰腺癌有关，其中一种重要的细胞凋亡抑制因子PEDF，免疫荧光定位试验表明该标记物在胰腺癌细胞核中大量表达，而在正常胰腺细胞胞质中大量表达，推测可作为人类胰腺癌诊断标记。核仁是细胞核内核糖体产生区域，介导核糖体生物发生和rRNA合成。Andersen J S［25］从HeLa细胞中提取核仁蛋白，鉴定的692个蛋白为核蛋白，鉴定出的蛋白能与90%已知酵母核蛋白相匹配，表明核仁蛋白高度保守。剪接体是位于胞核的多蛋白复合物，主要功能是执行前mRNA内含子的剪切。关于剪接体的亚细胞蛋白组学研究相对较少，但有报道指出利用亲和层析法分离得到高纯度的活性剪接体，接着通过蛋白组学技术共鉴定到145个剪接体蛋白，其中包含58个新的剪接体蛋白。

2.6 其他细胞器

中心体是动物细胞的微管组织中心，它通过对细胞骨架的影响参与细胞形状，极性和运动，且在细胞的分裂增殖中扮演重要作用。Andersen J S等［26］首次运用SDS－PAGE结合串联质谱方法对人中心体进行了研究，利用蛋白质校正谱图分析法确证中心体蛋白，并建立了中心体定位蛋白在五个密度梯度组分中肽段丰度与峰面积蛋白相关图谱，运用PCP技术找到137种中心体相关组分，随后利用免疫荧光方法验证了23种新的中心体蛋白质，同时，还找到了一些与疾病相关的蛋白质，如ALMS1蛋白。为了弄清中心体结构与功能联系的分子机理，最近Jakobsen L 等［27］利用PCP－SILAC质谱技术对人细胞中心体作了蛋白组学研究，这些蛋白组数据进一步促进中心体蛋白的功能分析。中间体为在细胞分裂期出现的来自于中心纺锤体的结构，其参与细胞的有丝分裂，一般出现在2个子代细胞即将分裂前的连接处。Skop A R等［28］对哺乳动物中间体进行蛋白组学研究，鉴定了160种候选中间体蛋白质，运用免疫荧光试验证实10种蛋白定位于中间体，为了明确这些蛋白是否参与细胞有丝分裂，利用RNA干涉试验显示80种蛋白与细胞有丝分裂有关，进一步研究发现内质网蛋白GRP94参与了细胞染色体分离。

3 亚细胞蛋白质组发展面临的挑战及展望

近年来，亚细胞蛋白质组学取得了长足的进展，但同样也面临诸多挑战，一是高纯度亚细胞器的获得，二是低丰度蛋白的鉴定及鉴定出的蛋白亚细胞的真实定位。目前，利用各种物理、化学或生物的方法都很难提取分离到绝对纯度的亚细胞结构，分离的蛋白很难100%确定来自于目标亚细胞结构。另外，有些蛋白质并不是固定存在于单个亚细胞位置上，而是动态的在多个亚细胞位置间转运，所以对于这种动态分布的蛋白质是混合污染还是有定位变化尚需进一步研究。随着差减蛋白质组方法、蛋白质校正图谱、FFE、免疫纯化技术、FAOS、LOPIT、PCP等方法的引入，以及生物信息学软件对蛋白亚细胞定位的预测，分离得到的亚细胞器纯度正在逐步提高，得到的亚细胞组分数据也越来越可靠。可以预见的是，由于整个细胞的蛋白质组的复杂性，随着技术的发展，比较亚细胞蛋白质组学将成为一个新的发展方向。

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