通管方对输卵管炎性阻塞性不孕大鼠模型VCAM－1，BAX表达的影响

郭 锐 匡继林 刘英奇 王立兰

（1.湖南中医药大学2009级研究生 湖南 长沙 410007；

2.湖南中医药大学第二附属医院 湖南 长沙 410005）

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：选健康清洁级8－12周健康未孕雌性 Wistar雌性大鼠大鼠180只，体重190－210g；成熟雄性大鼠15只，体重200－220g。以上动物由湖南中医药大学实验动物中心提供。

1.1.2 药物及试剂：通管方由湖南中医药大学第二附属医院中药房提供。血府逐瘀片，由潍纺中狮制药有限公司生产，批准文号：国药准字Z20100527；生产批号：20100527。原位杂交仪（ThermoBrite），购自上海深瑞仪器有限公司产品。湿盒 ：北京海生实验器材有限公司。PNP笔：北京世桥生物有限公司。

1.1.3 菌种：大肠杆菌，菌号 ATCC25922；金黄色葡萄球菌，菌号ATCC25923，由湖南省中医药大学微生物教研室提供、培养。溶血性链球菌，菌号ATCC25921，购自湖南省疾病控制中心。细菌悬液0.1ml（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌，按2∶1∶1用无菌水稀释，浓度为30×108／ml混合菌）。

1.1.4 主要实验仪器：普通光学显微镜（CK－Z），医用微波炉，BMJ－1型生物组织包埋机等。

1.2 方法

1.2.1 造模方法：造模方法借鉴马宝璋教授的“混合菌接种法”［2］。具体操作如下。把150只造模组大鼠禁食不禁水12h，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，待麻醉起效后将大鼠仰卧固定于手术台上，手术部位剪毛，碘酒、酒精消毒皮肤，下腹正中作一约0.8－1cm长纵切口，打开腹腔，暴露一侧部分子宫、输卵管及卵巢，在子宫靠近输卵管处向输卵管方向注入混合细菌液0.1ml。造模过程中尽量避免损伤其他组织器官，缝合腹壁肌层、皮肤，再以75%的酒精消毒切口，同法处理对侧。术毕将大鼠仰卧位放入鼠笼内，待其自然苏醒，然后观察术后大鼠的情况，逐只大鼠进行造模；于造模术后第5、10、15、20天分别随机从每组中抽样对输卵管进行肉眼观察及病理组织形态学观察。

1.2.2 给药方法：雌性大鼠造模后共死亡25只，取材4只，存活121只。再按随机排列表法分为模型组24只、血府逐瘀片组25只、通管方高剂量组24只、通管方中剂量组24只、通管方低剂量组24只。通管方低、中、高剂量组的给药剂量为每毫升含生药1.85g，3.70g，7.40g。阳性对照药血府逐瘀片：使每毫升溶液含血府逐瘀片0.03g。于造模术后第20天开始经口灌胃给药，每日一次，其中通管方低、中、高剂量组分别灌服低、中、高三种剂量的通管方水煎剂，血府逐瘀组灌服血府逐瘀片混悬液，模型组灌服等量蒸馏水，灌胃体积为1.5ml／100g，正常组常规喂养。所有大鼠同一天开始灌胃，在灌胃15天、30天从各组中随机抽样8只进行取材，剩下的大鼠停止灌胃，用于观察治疗后受孕情况。

1.2.3 观测指标

（1）组织形态的观测：肉眼观察观察输卵管外观形态、色泽变化、与周围组织粘连情况、是否有增粗或变细、以及有无积水或化脓等。观察后，迅速切取输卵管，放入4%多聚甲醛中固定，常规切片，HE染色，光镜下观察。

（2）VCAM－1，BAX检测：原位杂交法检测上皮细胞中VCAM－1，BAX的含量，用平均光密度值表明。

（3）大鼠受孕情况：灌胃结束后，观察各组大鼠的受孕情况。

2 结果

2.1 组织形态学变化

15天观察结果为：HE染色观察结果为：正常组、模型组改变基本同前；血府逐瘀组：管壁结构分界欠清晰，纤毛凌乱，部分脱落且融合粘连，大量纤维结缔组织增生及炎性细胞浸润；通管方低剂量组：管壁增厚结构欠清晰，管腔狭窄，纤毛仅部分可见且粘连相互融合，大量纤维结缔组织增生及炎性细胞浸润；通管方中剂量组：管壁增厚，管腔缩小，纤毛部分脱落，粘连增粗，多量纤维结缔组织增生及炎性细胞浸润；通管方高剂量组：管腔基本通畅，管壁略粗结构欠清晰，纤毛增生，血管充血，少量纤维结缔组织增生及炎性细胞浸润。

30天后HE染色结果为：

HE染色结果为：正常组、模型组改变基本同前；血府逐瘀组：管壁增厚，管腔尚通畅，纤毛较少可见粘连增粗，纤维结缔组织明显增生及炎性细胞浸润；通管方低剂量组：管腔缩小，纤毛数量少，凌乱增粗，纤维结缔组织增生及多量炎性细胞浸润；通管方中剂量组：管壁略厚，管腔通畅，纤毛部分粘连，少量纤维结缔组织增生及炎性细胞浸润；通管方高剂量组：30天管腔通畅，管壁组织结构较清晰，纤毛较多，分支少无粘连，灶性结缔组织增生，无炎性细胞浸润。

2.2 治疗后上皮细胞中VCAM－1检测结果：VCAM－1在正常组大鼠输卵管上皮细胞中未见表达，模型组阳性表达比较明显，与正常组比较差异有显著统计学意义（P＜0.01）。平均光密度值的统计学资料表明：药物干预15，30天后，统计分析表明各组间VCAM－1含量差别均具有统计学意义（P＝0.000）。15，30天的对比具有统计学意义。不同分组的平均光密度是不同的。正常组与模型组，血府逐瘀组，通低组，通中组差别具有统计学意（P＝0.000），与通高组差别不具有统计学意义（P＝0.278）。模型组与各组差别具有统计学意义（P＝0.000）。血府逐瘀组与通低组差别不具有统计学意义（P＝0.05）。详见表1。

2.3 治疗上皮细胞中BAX检测结果：BAX在正常组大鼠输卵管上皮细胞中有一定量的表达，模型组的阳性表达明显高于正常组，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。平均光密度值的统计学资料表明：经药物干预15天后，正常组与模型组，血府逐瘀组，通低组，通中组组间差异具有统计学意义（P＝0.01），与通高组组间差异不具有统计学意义（P＝0.055）。血府逐瘀组与通低，中，高组组间差异具有统计学意义。通低组与通中，高组组间差异具有统计学意义。通中组与通高组组间差异具有统计学意义（P＝0.01）。经药物干预30天之后，各组间差异均具有统计学意义（P＝0.000）。

表1 各组大鼠输卵管上皮细胞VCAM－1蛋白表达强度的比较 （±s）

表1 各组大鼠输卵管上皮细胞VCAM－1蛋白表达强度的比较 （±s）

注：15天多组比较F＝110.735；30天多组比较F＝197.731；与正常组比较△P＝0.000＜0.01；与模型组比较☆P＝0.000＜0.01，★P＝0.000＜0.01，★★P＝0.000＜0.01；与血府逐瘀组比较◆P＝0.000＜0.05，◇P＝0.000＜0.01；与通管方高剂量组比较＃P＝0.000＜0.01，＃＃P＝0.000＜0.01，＃＃＃P＝0.000＜0.01。

组别 n 15天 30天正常组8 0.000 0.000模型组 8 0.293±0.053△ 0.354±0.032△血府逐瘀组 8 0.185±0.027☆ 0.185±0.026★通管方低剂量组 8 0.131±0.022＃＃＃ 0.160±0.034★★＃通管方中剂量组 8 0.083±0.020★＃ 0.089±0.024◆＃＃通管方高剂量组 8 0.021±0.026★◇ 0.015±0.020★◇

15，30天的对比表明具有统计学意义。不同分组的多重比较具有统计学意义，正常组与模型组，血府逐瘀组，通低组，通中组差别具有统计学意义（P＝0.000），与通高组差别不具有统计学意义（P＝0.134）。模型组与各组差别具有统计学意义（P＝0.000）。血府逐瘀组与各组差别具有统计学意义（P＝0.000）。通管方各剂量组间差别具有统计学意义（P＝0.000）。详见表2。

表2 各组大鼠输卵管上皮细胞BAX表达强度的比较±s）

表2 各组大鼠输卵管上皮细胞BAX表达强度的比较±s）

注：15天多组比较F＝121.050；30天多组比较F＝233.008；与正常组比较△P＝0.000＜0.01；与模型组比较☆P＝0.001＜0.01，☆☆P＝0.001＜0.01，★P＝0.000＜0.01，★★P＝0.000＜0.01；与血府逐瘀组比较◇◇P＝0.000＜0.01；

组别 n 1 5天 3 0天正常组 8 0.0 0 1±0.0 1 5＊0.0 0 2±0.0 1 8模型组 8 0.3 2 7±0.0 5 6△ 0.3 6 1±0.0 3 6△血府逐瘀组 8 0.1 8 9±0.0 2 8☆ 0.1 9 3±0.0 3 7☆☆通管方低剂量组 8 0.1 2 9±0.0 2 1＊＊ 0.1 2 3±0.1 2 1★通管方中剂量组 8 0.0 7 6±0.0 2 3★＃ 0.0 6 9±0.0 2 6通管方高剂量组 8 0.0 1 5±0.0 2 3★★◇ 0.0 1 0±0.0 1 9★★

2.4 对各组大鼠受孕情况的影响。结果显示，与正常组比较，模型组、对照组、通低组差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。与正常组比较，通高组、通中组差异不具有统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，通高组差异具有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，通高组、通中组差异具有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）；与通高组比较，通中组、通低组差异无统计学意义（P＞0.05）；通中组与通低组比较差异无统计学意义（P＞0.05），与对照组比较，通高组、通中组、通低组差异无统计学意义（P＞0.05），详见表3。

表3 各组大鼠受孕情况

5 讨论

现代中医认为，输卵管炎性阻塞性不孕的病机为气滞血瘀。目前对血瘀证的研究已经进入细胞学和分子生物学水平［3］，概括起来主要为：血瘀证在血液流变学、血小板功能、内皮细胞功能、微循环研究、血流动力学、免疫功能变化等方面的研究［4］。VCAM－1属于黏附分子家族中的一员［5］，它在静息的白细胞、内皮细胞上呈低水平表达。体内在炎症的病理条件下VCAM－1表达在血管内皮上［6］。

实验结果表明：造模后模型组l0天、20天观察VCAM－1含量明显增多，高于正常组，说明VCAM－1参与了输卵管的慢性炎症反应。经中药水煎剂治疗后，尤其是通高组，VCAM－1的含量明显下降，说明降低VCAM－1含量可能是中药汤剂治疗炎性阻塞性不孕症的机制之一。

BAX是BCL－2家族的前凋亡蛋白，是细胞损伤和刺激的传感器［7］。1997年Koshida等利用免疫组织化学和临床病理学方法研究胃癌细胞的凋亡，指出Bax高表达时，则凋亡指数高，Bax低表达或不表达时凋亡指数低［8］。

实验结果表明：模型组中BAX的含量在5，10，15，20天观察中发现呈上升趋势，明显高于正常组，并在第20天达到该实验中的最高值，说明BAX高表达，细胞凋亡指数高。经灌胃治疗后，观察15，30天输卵管中BAX发现其呈下降趋势，通高组下降弧度最大，说明细胞凋亡指降低，说明降低BAX的表达可能是中药汤剂治疗炎性阻塞性不孕症的机制之一。

6 通管方治疗输卵管炎性阻塞性不孕症的组方原则

中医认为输卵管炎性阻塞性不孕其病位在胞宫，胞脉，病机为气滞血瘀，根据实邪为病治以攻邪为主，邪去则正安的原则，应采用活血化瘀，通络止痛的治疗大法。通管方是谢剑南教授根据多年治疗输卵管阻塞性不孕症的临床经验，运用中医药理论组方而成，验之于临床，效果显著。通管方的组成：党参15g、炒白术15g、当归10g、赤芍10g、丹参10g、泽兰10g、香附10g、乳香10g、没药10g、王不留行10g、路路通10g、三七6g、穿山甲7g、穿破石20g、薤白10g、茺蔚子10g和甘草5g。全方重在活血化瘀、通经活络。为了使药物能充分的吸收，特将穿山甲，田三七研粉冲水吞服。另外服用该方，部分患者会出现大便稍稀，由此认为通管方可能使肠蠕动增加，有利于输卵管粘连的松解。

本课题根据临床常见病例，选择了感染途径与人类炎症机制接近的动物模型。从致病病因来看，混合性病原体致炎符合临床情况。从受体来看大鼠对致病菌也较为敏感。本研究从生理病理及生化角度研究了VCAM－1及BAX在输卵管模型中的表达情况，从而揭示了通管方的作用机制，为为本药的临床应用提供理论依据。

［1］金维新.不孕症的诊断与中医治疗［M］.科学出版社.

［2］马宝璋，王树林，方凤奇，等.炎克宁冲剂对大鼠慢性盆腔炎局部免疫功能的调节作用［J］.中国中医药科技.2000，7（1）：24－25

［3］孙艺红，黄永麟，张瑞英，等.Irbesartan对动脉粥样硬化血管细胞粘附分子－1mRNA表达的影响.中国动脉硬化杂志，2001；9（5）：401～404

［4］胡小勤，陈利国.血管内皮细胞粘附分子与血瘀证相关性探讨.陕西中医2005，26（3）；249－250

［5］苏敏，钟翠平.动脉粥样硬化病变中黏附分子ICAM－1、VCAM－1及E－selectin的表达［J］.第三军医大学学报，2009，31（11）：1066－1068

［6］侯玉芬，刘明，刘政，张玥，王彬.消栓通脉颗粒剂对深静脉血栓形成大鼠模型静脉壁中VCAM－1、PSGL－1表达的影响.中国科技论文在线，2008：1－5

［7］Tsukaharas S，Yamamoto S，Shew TT，et al1Inhalation of low 2level formal 2dehyde increases the bcl22／bax exp ression ratio in the hippocampus of immunologically sensitized mice ［J］.Neuroimmunomodulation， 2006； 13（2）：63281

［8］Koshida Y，Saegusa M，Okayasu I.Apoptosis cell proliferation and expression of Bcl－2and Bax in gastric carcinoma immunhisto－chemical and clinic pathological study［J］.Br J Cancer，1997，75（3）：367