左乙拉西坦基础研究进展

(湖州市中心医院神经内科，浙江 湖州 313000)

左乙拉西坦基础研究进展

晏玉奎，王庄*(湖州市中心医院神经内科，浙江 湖州 313000)

目的 介绍新型抗癫痫药物左乙拉西坦(LEV)基础动物实验研究方面的进展。方法 通过查阅近年来的报道，概括了LEV作用于癫痫动物模型的机制、以及与癫痫耐药相关蛋白、脑保护的关系。结果 LEV具有与既往抗癫痫药物不同的作用机制，不仅有抗癫痫作用，还具有抑制癫痫源产生和发展的作用。多数报道LEV不是常见耐药蛋白如P-gp和MRP1/2，MDR1的底物，在难治性癫痫的治疗中具有理论基础，同时LEV在神经保护方面急性期多具积极作用，而在慢性期效果不明显。结论 大量动物实验证明LEV具有全新的作用机制，对于临床癫痫的治疗具有重要指导意义，但在不同癫痫模型及组织中结果不尽相同，值得进一步探讨，为开发新的抗癫痫药物提供借鉴。

癫痫；左乙拉西坦；基础实验

左乙拉西坦(levetiracetam，LEV) 是吡拉西坦的类似物，属于第二代乙酰胆碱激动剂[1]。吡拉西坦是临床常用的改善记忆和认知功能的药物，动物实验证明有微弱的抗抽搐效应[2]，1992年比利时UCB公司研究者Gower观察到吡拉西坦的(S)-乙基对映异构体对听源性癫痫动物模型的抗抽搐效果强于吡拉西坦[3]，之后在多种癫痫动物模型中也证实有较强的抗癫痫作用[4]，新的抗癫痫药物LEV由此诞生，其化学名称为(S)-α-乙基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺。LEV上市后，临床治疗癫痫，因具有广谱抗癫痫药(AEDs)的特点，其适应证及使用人群逐渐扩大，目前在全球范围内，LEV成功运用于添加治疗成人及儿童的癫痫部分性发作或继发全面发作，还可以单药治疗癫痫的部分性发作或继发全面发作，包括肌阵挛癫痫、青少年肌阵挛癫痫以及其他全面发作性癫痫[5]，特别是在难治性局灶性癫痫发作方面，近期的一项荟萃分析总结了11个临床试验结果，共1 861例患者纳入研究，受试的成人日剂量在1 000～4 000 mg之间，儿童为60 mg·kg-1·d-1，以发作频率减少≥50%为目标，结果成人及儿童分别有39%和52%的患者达标，而安慰剂组分别为25%和16%，显示出LEV处理难治性癫痫的优势[6]。

1　LEV的药物代谢动力学

LEV具有较高的水溶性,具有较理想的药代动力学，口服易吸收，3 h后达血药浓度峰值，生物利用度＞95%，呈线性药代动力学，增加口服剂量则血药浓度呈比例增加，其蛋白结合率小于10%，主要由肾原形排出(93%在48 h内排出)，成人半衰期为(7±1) h，故2次·d-1服药，2 d达到血药稳态浓度。老年人由于肾脏清除率弱故半衰期增加40%，儿童半衰期为5～6 h。因LEV和代谢产物不抑制肝细胞色素P450酶系统和葡萄糖醛基转移酶，故与其他药物相互作用弱[7]，这一结果在癫痫动物模型中得到证实，Luszczki[8]处理难治性癫痫时，用LEV分别联合卡马西平，丙戊酸钠，苯妥英钠，苯巴比妥，托吡酯，奥卡西平，拉莫三嗪，观察其抗癫痫效应，并通过高效液相色谱法(HPLC)测定脑内各AEDs的浓度，发现彼此的浓度不受影响。同样的结果也在癫痫患者中得到证实，Otoul观察了187例儿童癫痫，LEV分别联合卡马西平，丙戊酸钠，托吡酯，拉莫三嗪，LEV添加治疗前后分别测定AEDs的血清浓度，卡马西平为8.4，8.1 µg·mL-1(变异系数CV=30%；90% CI：0.909～1.00，n=35)，丙戊酸钠83.8 µg·mL-1，82.5 µg·mL-1(变异系数CV=38%；90% CI：0.917～ 1.007，n=23)，托吡酯7.3 µg·mL-1，7.2 µg·mL-1(变异系数CV=82%；90% CI：0.900～1.041，n=28)，拉莫三嗪8.2 µg·mL-1，7.7 µg·mL-1(变异系数CV= 62%；90% CI：0.872～1.081，n=22)[9]。

2　LEV的药理学特征与作用机制

2.1LEV对癫痫动物模型的干预作用

LEV首先是在听源性癫痫发现其具有抗抽搐效应，但后来发现对最大电休克和最大剂量戊四氮所致的急性癫痫模型，LEV缺乏抗抽搐效果，却对电点燃和戊四氮点燃的慢性模型有保护作用，而其他新型AEDs对急性和慢性模型都具有很显著的效果[10]。Gibbs[11]等通过电刺激大鼠穿通纤维-海马通路2 h，建立急性循环癫痫持续状态模型self-sustaining status epilepticus(SSSE)，模型成功后，分别给予LEV 200，1 000 mg·kg-1以及生理盐水腹腔注射，在急性期44 h内监测皮层脑电图和发作行为学变化，发现低剂量和高剂量均不能抑制尖棘波的发放频率，而且低剂量不能改善发作行为Racine评分，但高剂量(1 000 mg·kg-1)则可以显著减少发作的程度和频率，同样Mazarati[12]的实验关于急性癫痫持续状态模型，预先静脉用LEV 10 mg·kg-1不能减少发作，30 mg·kg-1能减轻发作，50～1 000 mg·kg-1能阻止癫痫持续状态的发展，在典型的癫痫持续状态时LEV 200～1 000 mg·kg-1均能终止发作。而Smedt等建立快速点燃海马循环发作模型(rapid kindling with recurrent hippocampal seizures，RKRHS)[13]，腹腔注射LEV(54 mg·kg-1)， 1 h后发现痫样发作Racine评分等级显著少于对照组[(1.67±1.03) s vs (5.0±0) s，P＜0.05]，电生理指标后发放持续时间(after discharge duration，ADD)也显著少于对照组[(21.16±5.03) s vs (57.24± 8.16) s，P＜0.05]，但这种差异随着时间的延长逐渐减弱，2.5 h后LEV组与对照组没有差异(P＞0.05)，也就是说随着时间的延长LEV出现耐药现象，但是Löscher[14]的研究，关于杏仁核点燃慢性颞叶癫痫模型，对于LEV长期腹腔给药13，27或54 mg·kg-1，结果抑制发作的程度和时间呈剂量依耐性，而且还发现在缺乏LEV的情况下持续刺激杏仁核，大鼠发作行为学变化和电生理指标仍然显著低于对照组，由此提出LEV不仅有抗抽搐效应，还具有抑制癫痫源产生和发展的作用，同样的结果也被日本学者Yan所证实[15]，LEV较长时间给药于一种出生后先天自发性痫样发作幼鼠(SER)，在出生后的5到8周，LEV腹腔注射每天80 mg·kg-1，发现在停药5周后，发作仍被抑制，在第12周时发作也显著减少，作者认为LEV在鼠体内的t1/2只有2～3 h，停药后所具有的抑制效果表明，LEV不仅有抗抽搐效应，还具有抑制癫痫源产生和发展的作用。Glien[16]用匹鲁卡品点燃慢性自发性颞叶癫痫大鼠模型，皮下植入微渗透泵，在开始2周注入生理盐水(给药前期)，第3到4周注入LEV 200 mg·kg-1(给药期)，第5到6周换用皮下非药物微渗透泵(给药后期)，整个过程用视频监测系统观察，同时给药期间监测血药浓度均在临床有效范围内，结果发作频次给药前期为21.1 ±12.4，给药期为8.1±6.4，给药后期为24.8±9.7，差异有统计学意义，说明LEV对自发性慢性癫痫大鼠模型也有较好的抗抽搐效果。以上报道关于LEV干预各种急慢性癫痫模型的不同结果，可能与使用LEV的剂量不同或不同动物模型有关，需要进一步动物实验研究论证。

2.2LEV的脑保护作用

癫痫治疗目标不仅是控制发作，而且还需要不影响生活质量，甚至提高患者的生活质量，所以合理选择AEDs应是在控制发作的基础上，不影响神经心理社会功能，尤其是对脑生长发育阶段的患者。基础与临床研究显示许多AEDs根据自身作用机制不同具有或多或少的脑保护作用[17]。Kim[18]以出生后5～7 h的幼鼠为研究对象，发现苯巴比妥，苯妥英钠，丙戊酸钠诱导幼鼠脑局部神经元细胞程序性死亡，而大剂量的LEV(1 500 mg·kg-1)不会出现上述情况。Pavone[19]通过体外实验，观察AEDs各种浓度对培养12 d的星型胶质细胞的毒性作用，观察指标主要为LDH、谷氨酰胺合成酶(GS)、细胞内活性氧成份(ROS)、丙二醛(MDA)、诱导型一氧化氮(iNOS)的浓度变化以及DNA损伤水平、热休克蛋白70表达，48 h后发现卡马西平、奥卡西平、托吡酯无论高浓度还是低浓度都对星型胶质细胞有诱导应激反应作用，而LEV无论高或低浓度(1，10，50，100 µg·mL-1)都不改变细胞的代谢水平和诱导细胞毒性作用。Marini[20]将海人酸(KA)10 mg·kg-1腹腔注射致大鼠颞叶癫痫模型，LEV 50 mg·kg-1干预，通过测定脑组织丙二醛、谷胱甘肽水平及IL-1 mRNA含量，发现急性期24 h内LEV可以减少KA介导的组织过氧化损伤作用，并显著减少KA介导的海马CA1区神经元的丢失，说明LEV具有脑保护作用。但是Brandt[21]通过对基底节杏仁核持续电刺激，建立自发性再发作(SRS)大鼠癫痫模型，较长时间给药(8周)，发现癫痫持续状态所致海马损伤，LEV无神经保护作用，说明不能减少脑损伤后病变的远期进展。在血管源性损伤的研究中，实验性蛛网膜下腔出血及闭合性脑损伤的动物模型，LEV显示出神经保护作用[22]，而非在体大鼠皮质纹状体缺血性脑片的实验中，卡马西平、丙戊酸钠、托吡酯具有脑保护作用，而LEV则没有[23]。对于LEV神经保护在急性期报道多具积极作用，但在慢性期效果不明显，而且在体与非在体实验结果也不尽相同，故需要进一步探讨。

2.3LEV的作用机制

LEV与传统AEDs相比具有全新的抗癫痫机制。LEV类似物[3H]ucb 30889，具有和LEV结合位点较高的亲和力，Fuks等[24]用光亲和标记方法，用放射性自显影技术显示[3H]ucb 30889脑内的分布，发现海马齿状回，上丘脑及丘脑核团，小脑皮层密度较高，而大脑皮层，纹状体，下丘脑则相对较少，细胞、亚细胞水平研究发现突触囊泡密度较高，而神经元则相对较少，也就是说LEV的作用靶点主要是海马和中枢神经系统突触间隙，而位于突触间隙的突触囊泡蛋白SV2A (synaptic vesicle protein 2A)是其发挥抗癫痫作用的独特靶点。Lynch[25]实验表明脑膜及缺乏SV2A的突触囊泡不与氚标记的LEV衍生物相结合，即SV2A的存在是LEV与之结合的必须条件，正常突触囊泡融合过程是由可溶性的N-乙基马来酰亚胺敏感因子连接物复合体(Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein attachment protein receptors，SNARE)介导的，并激活突触胞膜以调节神经递质释放。Matveeva等[26]在杏仁核点燃大鼠癫痫模型的研究中，发现海马部位有7SSNARE复合物(7SC)持续性的沉积，这一过程伴随着N-乙基马来酰亚胺敏感因子(NSF)的消耗和SNARE调节器Tomosyn蛋白沉积的增加以及SV2沉积的增加，这和癫痫的产生和发展相关，同样的结果在癫痫患者中被揭示，van Vliet[27]在人类难治性颞叶癫痫海马硬化切除标本中，发现SV2的表达明显少于非难治性癫痫患者颞叶和正常颞叶组织，而LEV可以阻止7SC的沉积，增加突触SV2的含量，纠正神经递质释放，从而达到抗癫痫的作用，但LEV不影响NSF和Tomosyn，也不影响正常突触神经递质的释放。LEV其他抗癫痫机制还包括：治疗浓度时抑制海马CA1区锥体细胞高电压激活的N型钙通道[28]；阻抑电压门控钾通道延迟兴奋性电位的触发[29]；通过PKA介导的蛋白磷酸化激活ROMK1通道(钾通道)促进神经元静息膜电位的恢复，抑制兴奋性扩散[30]；同时还可以部分抑制谷氨酸盐的兴奋性和增加GABA能的抑制效果[31]，也有研究发现LEV作用于GABAA和钠通道受体发挥抗抽搐效应[32-33]。

3　LEV与多药耐药蛋白

耐药问题是临床治疗癫痫的核心问题，LEV单药治疗新发癫痫在中等治疗剂量(1 000 mg·d-1)时，发现有近50%的患者需要更换或添加其他AEDs[34]，即有药物抵抗现象，研究证实癫痫耐药与AEDs作用靶区多药转运蛋白高表达或其功能增强有关[35]，而传统AEDs苯巴比妥，苯妥英钠，卡马西平，丙戊酸钠，新型AEDs拉莫三嗪，奥卡西平，非氨酯均为耐药蛋白的底物[36-38]。基础研究LEV是否为多药耐药蛋白底物各家报道不一。LEV处理慢性癫痫动物模型时，有报道[15]长期给药可以出现耐药现象。Löscher[39]建立杏仁核点燃大鼠颞叶癫痫模型，在成功后的慢性期，连续3周给予腹腔注射LEV 108 mg·kg-1(每日3次)，在治疗早期阶段可以显著提高后发放电位阈值，从而减少抽搐的频率及程度，但是随着治疗时间的延长，LEV抗抽搐效能逐渐降低，说明LEV在处理慢性颞叶癫痫模型时，仍有耐药现象的发生，为了证明这种推测，Potschka[40]通过对大鼠皮质层植入微透析探针，腹腔注射LEV(50 mg·kg-1)，在先于LEV腹腔注射的30 min，用微透析探针在皮质层分别注射P-gp抑制剂维拉帕米和MRP1/2 抑制剂丙磺舒，对照组局部注射等体积脑脊液，然后透析液取于LEV腹腔注射后30～120 min，各时间点测定脑脊液和血浆LEV浓度，发现实验组和对照组没有变化，即使用P-gp和MRP1/2抑制剂后，细胞外液的LEV浓度并没有增加，说明LEV的浓度不会被P-gp或MRP抑制，不是耐药转运体的底物而被转运。同样，van Vliet[41]在电刺激致癫痫持续状态大鼠模型5～6个月后，应用连续微渗透泵法，在慢性阶段LEV重复间断给药(2周间隔)，然后用气相色谱法测定血浆和脑组织匀浆液LEV浓度，结果LEV能够完全进入脑组织中，并出现剂量依耐性的抑制慢性阶段痫性发作3～4 d，但是尔后抽搐的频率再次增加，而测定的LEV血浆浓度和脑内LEV水平并未改变，在停止2周给药后，再次给药，所有大鼠模型对LEV又显示出作用。由此笔者认为LEV起初对抑制抽搐有效果，但出现耐药后脑内LEV水平正常，这点支持LEV不是多药耐药转运体的底物，但对于不能较长时间控制癫痫发作的耐药性，可能是LEV对脑组织的一种适应而非发生在血脑屏障这一渗透层面。但是Baltes[42]通过体外细胞转染技术，用狗肾脏单层MDCKⅡ细胞株和猪肾脏LLC-PK1细胞株转染含有人类MDR1、MRP2及鼠mdr1a和mdr1b的cDNA序列，进而检测AEDs转运体的效率，发现LEV能被鼠P-gp转运而不被人类P-gp转运，而且均不被鼠和人类MRP2转运，即LEV不是人类MRP2和P-gp的底物，由此提出由于物种不同，多药转运体在难治性癫痫患者血脑屏障过表达的说法存在质疑，这是第一个直接关于非在体人类多药转运体介导AEDs的研究，但由于存在方法学的差别，Luna-Tortos认为大多数AEDs由于脂溶性存在高膜通透性，一侧给药易形成梯度浓度差，造成被动扩散转运而影响转运体的研究结果，通过技术改良，用一种膜两侧平衡溶液传输系统(CETA)作为研究平台，以人类MDR1转染LLCPK1单细胞层作为研究载体，在使用MRPs特异抑制剂MK571后，发现膜对侧LEV浓度较对照组(未使用MK571)有所提高，推断LEV是人类MRPs的底物[43]。以上研究结果不同，至少说明耐药蛋白—AEDs底物识别和转运系统可能存在物种和不同组织的差别，是否在人类难治性癫痫中也存在这种现象尚不能确定，人类在体研究多药转运体对LEV的作用尚未见报道，也未见到长期使用LEV的难治性癫痫患者脑内多药转运体表达水平及功能的研究。

4　结语

综上所述，LEV由于具有较好的耐受性，有较理想的药代动力学以及与其他药物相互作用少等特点，广泛运用于癫痫的临床单药或多药联合治疗。近年来，新型抗癫痫药物研发有逐渐增多的趋势，与传统抗癫痫药物比较，在耐受性方面具有较多优势，随着生物-心理-社会模式理念的重视，癫痫的治疗不仅需要考虑疗效，更需要关注患者的长期生活质量及生存状态。诸多的基础实验研究表明LEV和其他型抗癫痫药物有不同的脑内作用靶点，在难以处理的癫痫以及脑保护等方面获益更多。随着以LEV为代表的新型抗癫痫药物的研发使用，总结新型抗癫痫药物动物基础实验的新成果，有利于开发更多不同机制的抗癫痫药物投入临床使用，如提高GABA 能、降低GLU能神经传递、抑制电压门控离子通道和改变细胞信号传导通路等，新型抗癫痫药物的研发主要针对上述靶向蛋白，还可以利用癫痫动物模型筛选出新的具有抗惊厥作用的化合物而进一步验证，优化现有抗癫痫药物的结构，使其具有更好的疗效或耐受性，如LEV类似物Seletracetam已经取得较好的临床前期试验结果[44]。

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Progress of Levetiracetam Basic Research

YAN Yukui, WANG Zhuang*(Huzhou Central Hospital, Department of Neurology, Huzhou 313000, China)

OBJECTIVE To introduce the progress study of the new antiepileptic drug of levetiracetam in basic animal experiments. METHODS By investigating the international literatures in recent years, we summed up the role of levetiracetam mechanism in epilepsy animal models, and the relationship with epilepsy drug resistance protein, brain protection. RESULTS LEV has different mechanisms with previously antiepileptic drugs, which not only has antiepileptic effects, also has the role of suppressing the generation and development of epilepsy. According to the most reports that LEV is not a substrate of common drug resistance proteins such as P-gp, MRP1/2 and MDR1, in treatment of refractory epilepsy has a theoretical foundation, meanwhile LEV has more neuroprotective in acute phase of epilepsy model, not in the chronic period. COCLUSION A large number of animal experiments show that LEV has a completely new mechanism, for the clinical treatment of epilepsy has important guiding significance, but the results are different in different epilepsy models or organization which needs to be further investigated, to provide a reference for the development of new anti-epileptic drugs.

epilepsy; levetiracetam; basic research

R971.6

A

1007-7693(2013)05-0565-06

2012-09-18

晏玉奎，男，硕士，主治医师 Tel: (0572)2023301-2141 E-mail: yanyukuimedical@163.com*

王庄，女，主任医师 Tel: (0572)2023301-2131 E-mail: pxnwz@163.com