黄酮类放射增敏剂的研究进展

宋梦姣，刘宏，申玉莉 （.广州军区武汉总医院药剂科，湖北 武汉430070；2.湖北中医药大学药学院，湖北 武汉430065）

放射治疗是治疗恶性肿瘤的主要手段之一。但由于肿瘤细胞的生物学特性及局部微环境等，导致某些肿瘤细胞对射线的敏感性较低，因而放射治疗的效果较差。

放射增敏剂（radiosensitizing agents）与放疗联用，通过选择性地杀伤乏氧肿瘤细胞、抑制放射损伤修复、调节细胞周期等，来增强肿瘤细胞的放射敏感性，降低照射剂量，减少对正常细胞的损伤等［1］。但是，目前常用的放射增敏剂均有不同程度的毒副作用，如米索硝唑具有神经毒性、替拉扎明具有肌痉挛毒性、顺铂和5－氟脲嘧啶等具有胃肠道和血液系统毒性等［2］，从而限制了其在临床上的应用。黄酮类化合物（flavonoids）具有抗氧化、抗炎、镇痛、护肝等保护作用，其中具有增敏作用的有黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类、黄烷醇类、査耳酮类等，本文拟综述近年来国内外对黄酮类化合物作为放射增敏剂的研究进展及其作用机制。

1 黄酮类化合物的放射增敏作用

目前多采用体外细胞实验，也有少量移植性肿瘤动物实验、临床人体试验研究等。体外细胞实验主要是单细胞克隆实验，以放射增敏比（SER，即单纯放疗时达到某一效应的放射剂量与使用增敏剂时达到相同效应的放射剂量的比值）为评价指标，SER 值越大，则放射增敏作用越强。有些实验研究中，还将条件分为常氧和乏氧环境，使黄酮类化合物的放射增敏对象更有针对性。

1.1 黄酮类 芹黄素（apigenin）、木犀草素（luteolin）、白杨黄素（chrysin）等以2－苯基色原酮为基本母核，3位无含氧取代的一类化合物。将对数生长期的单层或球状体肺癌SQ－5细胞在含有40μmol·L－1芹黄素的培养基中孵育16 h，然后接受6 Gy－X射线辐照，继续培养8 h，结果发现芹黄素可以显著增强单层和球状体SQ－5细胞的放射敏感性和凋亡率，单层细胞实验中联合组比单纯放疗组的放疗效果增强了约2.1倍，而球状体细胞实验中增强了约1.5倍［3］。木犀草素与射线联用，不仅在体外可以增强人胃癌SGC－7901细胞的放射敏感性，还可显著增强SGC－7901细胞转移瘤的裸鼠的放射敏感性，10，20μmol·L－1木犀草素对SGC－7901细胞的放射增敏比分别为1.14和1.47，在SGC－7901细胞转移瘤的裸鼠模型上，木犀草素还可使肿瘤血管生长受到抑制［4，5］。白杨黄素对SGC－7901 细胞也显示相似的放射增敏作用，80 μmol·L－1白杨黄素与8 Gy－γ射线联合应用可明显增敏射线对肿瘤细胞的杀伤作用，促进肿瘤细胞的凋亡［6］。

1.2 黄酮醇类 槲皮素（quercetin）、漆树黄酮（fisetin）等在黄酮基本母核的3位上连有羟基或其他含氧基团。将槲皮素与射线联合应用于人结直肠腺癌上皮细胞DLD－1 细胞、宫颈癌HeLa细胞、乳腺癌MCF－7细胞，槲皮素对这3种肿瘤细胞的体外放射增敏比分别为1.87，1.65，1.74，在DLD－1细胞转移瘤的裸鼠模型上，槲皮素还能显著增强射线对肿瘤生长的抑制作用［7］；槲皮素在60～120μmol·L－1范围内，与γ射线（0～8 Gy）联用，可以增强常氧和乏氧条件下HeLa细胞的放射敏感性［8］；用0.3 mg·mL－1槲皮素作用于人前列腺癌PC－3细胞3，6，12，24 h后，放疗加药组均可见放射增敏效应，相应的放射增敏比分别为1.22，1.58，1.76，1.85，放射增敏效应随药物作用时间延长而增强［9］。p53 野生型结直肠癌HCT116细胞对射线较敏感，而p53突变型结直肠癌HT－29细胞对射线较抗拒，但在4 Gy－X 射线辐照前给予这两种细胞50μmol·L－1漆树黄酮作用24 h后，HT－29细胞的存活率可降至8.5%，而HCT116细胞的存活率仅降至41%［10］。

1.3 异黄酮类 母核为3－苯基色原酮结构，主要存在于豆科植物中，是黄酮类放射增敏剂中研究得较早、较多也是较深入的一类，主要包括染料木黄酮（genistein）、黄豆苷元（daidzein）、黄豆黄素（glycitein）等，由于这些化合物与哺乳动物雌激素结构相似，因此具有雌激素样作用，尤其对激素相关疾病如乳腺癌、前列腺癌等有一定作用，如染料木黄酮作为放射增敏剂，在体外实验中，对乳腺癌BR231细胞［11］、前列腺癌LNCaP、PC－3和C4－2B 细胞［11－13］均显示 较 强 的放射增敏作用，对其他肿瘤细胞如宫颈癌Hela细胞［14－15］、肾癌KCI－18和RC－2细胞［11］、非小细胞肺癌A549细胞［16］等，一定浓度的染料木黄酮也可增强上述肿瘤细胞的放射敏感性，而对正常细胞无增敏作用，除此之外，在PC－3细胞、KCI－18细胞转移瘤的裸鼠模型中证实了染料木黄酮在体内也具有放射增敏作用［17－18］。但是，在PC－3细胞转移瘤的裸鼠模型中研究发现，单独使用染料木黄酮会促使癌细胞向腹主动脉旁的淋巴结转移，而单独使用异黄酮类混合物（43%染料木黄酮＋21%黄豆苷元＋2%黄豆黄素）却不会引起癌细胞转移，且其放射增敏作用强于染料木黄酮［17］。黄豆苷元在使PC－3 和C4－2B细胞放射增敏的同时也不会引起癌细胞转移，但其增敏作用弱于染料木黄酮和异黄酮类混合物［12］。

1.4 黄烷醇类 其结构中C环上的3或4位存在羟基。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是黄烷醇类的衍生物，25 μmol·L－1EGCG 可提高不同剂量（0，2，4，6 Gy）的X 射线辐照后人肝癌HepG2细胞的凋亡率，其中以放射剂量为2 Gy时作用比较明显［19］；微血管系统被认为是人脑癌进行放疗的作用靶点，人脑微血管内皮细胞HBMEC 细胞用EGCG预处理后的细胞存活率比单纯放疗组降低了40%［20］；其他一些研究表明，EGCG 与放疗联用同样可提高胶质母细胞瘤U－87细胞的体外放疗效应［21］；将EGCG 用于同时接受放射治疗的乳腺癌患者，每日服用3次，每次剂量为400 mg，连续服用5周，治疗结果显示，EGCG 联合放疗组患者的治疗效果好于未服药的单纯放疗组患者，并且用BR231 细胞进行体外实验时，5～10μmol·L－1EGCG 可显著增强放 疗效果［22］。

1.5 査耳酮类 为二氢黄酮C环的1、2位键断裂生成的开环衍生物。2′，5′－二羟基査耳酮（2′，5′－dihydroxychalcone）、2，2′－二羟基査耳酮（2，2′－dihydroxychalcone）属于多羟基査耳酮类，这两种二羟基査耳酮化合物对人结直肠癌HT－29细胞、人胰腺癌Panc－1细胞均具有放射增敏作用，10μmol·L－12，2′－二羟基査耳酮联合4 Gy射线作用于HT－29 细胞后，细胞相对活力为0.43，而2′，5′－二羟基査耳酮要产生与2，2′－二羟基査耳酮相当的放射增敏效应，所需浓度为20 μmol·L－1，即2，2′－二羟基査耳酮的放射增敏作用是2′，5′－二羟基査耳酮的2倍。用相当于临床常用剂量的2 Gy体外照射剂量进行实验，2 Gy射线不能明显杀死HT－29细胞，但预先用10μmol·L－12，2′－二羟基査耳酮处理后，2 Gy射线可以使HT－29细胞的存活率下降至0.53，即2，2′－二羟基査耳酮可以使放疗效应提高约2倍［23］。

1.6 其他类 夫拉平度（flavopiridol）是一种合成黄酮类药物，也是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。对放疗抗拒的p53突变型神经胶质瘤细胞A172细胞和bcl－2过度表达型宫颈癌HeLa细胞辐照后给予夫拉平度，它们的放疗效应均增强，但在其亲代野生型细胞中却观察不到放射增敏效应，说明p53、bcl－2 基因可能与肿瘤细胞的放射敏感性相关［24］；其他研究也表明，夫拉平度可以使人食管腺癌SEG－1细胞、宫颈癌HeLa细胞等的体外放射敏感性增强［25－26］，同时可以使神经胶质瘤细胞GL261细胞、结肠癌HCT－116细胞、胃癌MKN－74细 胞、肺 癌H460 细 胞、卵 巢 癌OCA－1 细胞转移瘤的裸鼠模型等的体内放射敏感性增强［27－28］。

2 黄酮类化合物的放射增敏机制

2.1 抑制放射损伤修复 放疗引起DNA 单链断裂（SSB）、双链断裂（DSB）、碱基损伤和蛋白质交联等多种类型的损伤，其中DSB是较严重的放射损伤之一，但细胞自身可将受损DNA 进行断链重接、切除或重组等多种类型的修复，使之恢复生理功能，从而使肿瘤细胞的放射敏感性降低，肿瘤细胞DSB修复率与细胞对射线的敏感性呈负相关［29］。细胞DSB损伤形成后，组蛋白H2AX 迅速磷酸化并形成γ－H2AX，随后募集损伤修复相关蛋白进行修复，而槲皮素、漆树黄酮能抑制H2AX 磷酸化，阻断修复通路［8，10］；DNA 依赖蛋白激酶（DNA－PK）能特异性地识别DSB，修复DSB 损伤，而夫拉平度可以下调DNA－PK 蛋白的表达，抑制DSB 修复［28］；槲皮素能抑制运动失调性毛细血管扩张症细胞突变蛋白（ATM）［7］；芹黄素、漆树黄酮、染料木黄酮会诱导多聚ADP核糖聚合酶（PARP）裂解［3，10－11］；染料木黄酮则是DNA拓扑异构酶（I和II）抑制剂［11］；夫拉平度还能抑制RNA 聚合酶II磷酸化［25］等。因此，黄酮类放射增敏剂可通过抑制DNA－PK、ATM、PARP等DNA 修复酶、DNA 拓扑异构酶和RNA 聚合酶等，来影响DNA 合成、转录和修复，从而抑制肿瘤细胞的放射损伤修复，提高放射线对肿瘤细胞的杀伤作用。

2.2 调节细胞周期 处于不同细胞周期时相的细胞对放射线的敏感性不同，对多数细胞而言，处于G1／S边界及G2／M期的细胞敏感性最高，处于S期尤其是晚S期细胞的放射敏感性最低，漆树黄酮、染料木黄酮与射线联用可将肿瘤细胞阻滞于G2／M 期［10－11，14］；细胞周期蛋白cyclin B1能促进G2／M 期转换而加速细胞周期进程，从而减少了细胞在这两个对射线最敏感期被击中的可能性，而染料木黄酮能下调肿瘤细胞内cyclin B1表达［11］；细胞周期蛋白cyclin D1主要调节细胞从G1期向S期的转变，肿瘤细胞内cyclin D1过度表达会使G1／S调控点失控，细胞不停进入细胞周期，而夫拉平度可以下调 肿瘤细 胞 内cyclin D1 表 达［24－26］；染 料 木 黄 酮 还 能 使肿瘤细胞内p53 基因表达增加，p53 通过激活p21、Gadd45等抑制cyclin B1－cdc2复合物的功能，来抑制肿瘤细胞由G2期向M 期转化和增殖，从而形成G2／M 期阻滞［15］。因此，黄酮类放射增敏剂可通过调节cyclin B1、cyclin D1和p53等，将肿瘤细胞阻滞在对放疗敏感性最高的G2／M 期，并调节细胞周期分布及细胞周期进程，从而提高肿瘤细胞的放射敏感性。

2.3 诱导肿瘤细胞凋亡 电离辐射会诱导肿瘤细胞内的核转录因子NF－κB、存活素survivin等表达上调，二者均与肿瘤细胞的放射敏感性相关。NF－κB 的异常激活可诱导促癌基因c－myc的激活，使其过量表达而抑制细胞凋亡、促进细胞生长和增殖，还可启动cyclin D1 的转录，促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，而抑制NF－κB 活性，则可诱导细胞凋亡；survivin是细胞凋亡抑制基因家族中的一个成员，在许多恶性肿瘤组织中均有过表达，仅存在于哺乳动物中，主要表达于细胞周期中的G2／M 期，参与调节细胞周期，通过抑制细胞凋亡蛋白 酶－3 和－7（caspases－3，－7）的 活 性，来 抑 制 细 胞 凋 亡。染料木黄酮、黄豆苷元、黄豆黄素通过抑制NF－κB 表达［11－13］，白杨黄素、染 料 木 黄 酮、EGCG 通 过 抑 制survivin表达来诱导肿瘤细胞凋亡［6，14，21］。另外，染料木黄酮与射线联用能使促凋亡蛋白Bax等表达上调［11－12］，芹黄素、木犀草素、白杨黄素、染料木黄酮能使抗凋亡蛋白Bcl－2 等表达下调［3－4，6，15］，木犀草素、白杨黄素、漆树黄酮还能激活作 为 细胞凋亡效应器的caspases－3［4，6，10］。因此，黄酮类放射增敏剂可通过抑 制NF－κB、survivin、Bcl－2 等 抗 凋 亡 因 子，上 调Bax、caspases－3等促凋亡因子，来诱导肿瘤细胞凋亡。

2.4 抑制新生肿瘤血管 肿瘤细胞的生长、转移依赖新生血管的形成，血管内皮生长因子（VEGF）是最有效的促血管生长因子。环氧合酶－2（COX－2）在恶性肿瘤的血管生成中也具有重要作用，并且COX－2和VEGF 在多种恶性肿瘤中共表达，二者密切相关，COX－2上调VEGF 的表达和肿瘤血管生成相关，而且COX－2上调VEGF 表达的机制可能是通过合成前列腺素E2（PGE2），则这3种因素可能相互作用，通过促进肿瘤血管新生来降低肿瘤细胞对射线的敏感性。放疗同样会诱导肿瘤细胞内的VEGF、COX－2 和PGE2 含量上升，促进新生血管形成，最终导致放疗后的肿瘤复发，这也是影响肿瘤放疗效果的一个因素。研究发现，木犀草素、染料木黄酮、黄豆苷元、黄豆黄素、夫拉杜平均可以抑制放疗诱导的VEGF增加［4，13，27］，染料木黄酮能抑制COX－2表达［15］，木犀草素、染料木黄酮还能使PGE2 合成减少［4，15］。因此，黄酮类放射增敏剂可使VEGF、COX－2 和PGE2 分泌减少，从而抑制新生肿瘤血管。

2.5 调节ROS 在有氧环境下，电离辐射会与细胞内的水分子发生辐解反应，产生活性氧ROS等自由基，ROS会造成DNA、生物膜及其他生物大分子等氧化损失，最终导致细胞死亡或凋亡。但是，细胞内的抗氧化酶及清除自由基的酶等可以抵御氧化损伤，维持细胞内的氧化还原平衡状态。因此，细胞内ROS含量及氧化平衡状态可以成为放射增敏的作用靶点。黄酮类药物清除氧自由基的作用已被证实，且已应用于辐射防护剂的研究中，但也有文献报道黄酮类药物在一定条件下具有促氧化作用，Shin等［15］在研究染料木黄酮对宫颈癌CaSki细胞的放射增敏作用时发现，染料木黄酮可以增加辐照所诱导的ROS含量，这种效应能被抗氧化剂N－乙酰半胱氨酸抑制，且实验结果表明细胞凋亡是通过ROS含量增加所诱导的。目前，在研究黄酮类药物的放射增敏作用时，关于其调节ROS含量的研究还较少，但细胞内ROS含量作为放射增敏的作用靶点是一个值得深入探讨的课题。

3 小结

综上所述，黄酮类化合物对不同肿瘤细胞具有较强的放射增敏作用，其主要是通过抑制放射损伤修复、调节细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制新生肿瘤血管、调节ROS等来增强肿瘤细胞的放射敏感性，这些特性使其有可能成为放射增敏剂而运用于临床。同时，黄酮类化合物还具有抗氧化、抗炎、镇痛、护肝等保护作用，使其有可能降低射线对正常细胞的损伤。虽然实验研究均显示黄酮类化合物可通过各种途径起放射增敏作用，但某些化合物的增敏机制尚不十分明确，不同的黄酮类化合物对肿瘤细胞的特异性有可能不同，且目前的研究多集中在体外细胞实验方面，对模拟人体内环境的动物实验较少，因此，应进一步加强增敏机制的研究，加强药物对病种特异性的研究，加强动物实验的研究，筛选出能够真正应用于临床、高效低毒、价廉的黄酮类放射增敏剂。

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