从千金子中提取高纯度千金子甾醇的工艺研究

李玉山 王经安

（陕西惠丰制药有限公司，长武 713600）

千金子为大戟科植物续随子（Euphorbia IathyrisL.）的干燥成熟种子，又名千两金、菩萨豆、续随子、拒冬实、联步、拒冬子、滩板救、看园老、百药解、干金药解、小巴豆。主要分布于我国华东、华中、华南、西南及陕西等地。种子含油48%～50%，油中含多种脂肪酸，主要有油酸89.2%，棕榈酸5.5%，亚油酸0.4%，亚麻酸0.3%等，油中还含菜油甾醇，豆甾醇，β－谷甾醇，千金子甾醇，巨大戟萜醇－20－棕榈酸酯，7－羟基－千金藤醇－二乙酸－二苯甲酸酯，巨大戟萜醇 －1－H－3，4，5，8，9，13，14－七去氢 －3－十四酸酯、千金藤醇 －3，15－二乙酸 －5－苯甲酸酯、千金藤醇－3，15－二乙酸－5－烟酸酯，巨大戟萜醇－3－棕榈酸酯，17－羟基岩大戟－15，17－二乙酸－3－O－桂皮酸酯，17－羟基－异千金藤醇－5，15，17－三－O－乙酸－3－O－苯甲酸酯，7－羟基千金藤醇－5，15－二乙酸－13－苯甲酸酸－7－烟酸酯及三十一烷醇等。种子还含瑞香素，马栗树皮苷，千金子素及异千金子素。千金子中的瑞香素油抗炎镇静及抑菌作用，七叶树苷有泻下逐水利尿作用，破血通经等生理活性和功效。用于治疗水肿、疾饮、积滞胀满、二便不通、血瘀闭经、毒蛇咬伤、晚期血吸虫病腹水等，外治顽癣、疣赘［1］。种子中主含脂肪油，香豆素类及甾醇类成分，具有逐水消肿，破血散结功效。最近研究报道有治疗白血病、食管癌、皮肤癌、疣赘、抗肿瘤及美白作用［2－3］。千金子中脂肪油的含量高达 50%以上［4－5］，油中含千金子甾醇，能刺激肠管产生腹泻，具有导泻作用，其程度为蓖麻油的3倍［6］。千金子甾醇化学名为千金二萜醇二乙酸酯苯酸酯。房子婷等［7］研究表明具有抑制黑色素生成，去祛斑，除色素，美白功效。本试验研究千金子甾醇的提取纯化工艺，以期为千金子的开发利用提供借鉴。

1材料与方法

1.1 材料与仪器

千金子：成都荷花池药材市场，产地陕西宁强；对照品：Sigma公司；甲醇，石油醚（60～90℃），乙酸乙酯均为分析纯。

R－201旋转蒸发器：上海申科机械研究所；BS1101型电子分析天平：北京赛多利斯仪器公司；101－2－BS电热真空烘箱：上海跃进医疗有限公司；Waters 486高效液相色谱仪：美国；LYZX24型低温螺旋榨油机：郑州企鹅粮油机械有限公司。

1.2 检测方法

1.2.1 千金子甾醇的高效液相检测条件

色谱条件：以Nova－PaRC18 Column（150 mm×4.6 mm×5μm）为固定相，甲醇∶水 ＝100∶4（V／V）为流动相，检测波长210 nm，流速1.0 mL／min，进样量20μL。

1.2.2 含油量的测定

按GB 10359—1989方法进行。

1.2.3 水分的测定

按GB 10358—1989方法进行。

1.3 提取工艺流程

提取工艺流程图见图1。

图1 提取次数的影响

千金子中含油较高，采用冷榨法榨油得到粗油，油中含有较多杂质，用石油醚萃取，饼粕和油渣再用石油醚提取，萃取的石油醚用纯化水反萃取出其中的水溶性成分，达到进一步除杂目的。石油醚用干燥剂脱水后再经柱色谱，得到高纯度千金子甾醇。

1.4 冷榨出油工艺研究

1.4.1 冷榨工序

LYZ×24型低温螺旋榨油机，入榨料温43～53℃，水分8%左右，进料时先少后多，逐渐加量，禁止下料过快，不断捅料门，防止断料，断料时间或停机时间一般不超过10 min，主电机配置变频器，榨油机先调速至15 r／min，待温度上升至60℃时，调至11 r／min，并分2～3次把饼粕厚度调至10 mm左右，主机电流40～45 A。

1.4.2 冷榨工艺指标优化

以原料温度分别为20、24、28℃考察了饼粕残油率，饼粕含水量，出饼温度。

1.5 饼粕提取工艺研究

由于饼粕仍残留有效成分，故需用溶剂浸出，以等量（V／m）石油醚（60～90℃）提取，对主要提取影响因素，提取时间，提取次数，提取温度，饼粕水分含量进行了考察。

1.5.1 提取次数的影响

以等量（V／m）石油醚在60℃下提取1 h，分别提取1、2、3、4次，烘干滤饼，测定滤饼残油率。

1.5.2 提取时间的影响

以等量（V／m）石油醚在60℃下分别提取1、2、3、4 h，烘干滤饼，测定滤饼残油率。

1.5.3 饼粕含水量的影响

以含水量分别为4%、6%、8%的饼粕在60℃下分别提取1 h，烘干滤饼，测定滤饼残油率。

1.6 萃取与反萃取工艺研究

1.6.1 冷榨油的萃取

由于冷榨出油中含有大量杂质，需要进一步去除，达到初步纯化的目的，为下一步的分离纯化减轻负担，故需用低极性溶剂对榨出的油进行萃取，本试验采用60～90℃石油醚对榨出的油进行萃取，以萃取剂用量，萃取时间，萃取温度，萃取次数为考察对象，以萃取液中的千金子甾醇的含量（mg／mL）为考察目标，采用L9（34）正交试验进行工艺优化（表1）。

表1 试验因素水平表

1.6.2 石油醚的反萃取

主要是用水洗去石油醚中的亲水性杂质，达到进一步除杂目的。由于该步骤主要采用水反萃取，因此对于工艺的要求不是很严格，可参照萃取过程的优化工艺。

1.7 柱色谱工艺研究

为了得到高纯度（质量分数98%以上）的千金子甾醇，柱色谱是必需的，对柱色谱中的填料，不同流动相配比，不同流速，色谱柱不同高度与直径比（高径比），不同柱温对洗脱液中千金子甾醇的含量（mg／mL）及回收率（%）的影响进行了考察。

2 结果与讨论

2.1 冷榨出油工艺

原料经一次压榨，饼粕成瓦块状，内面光滑无油迹，呈棕褐色，背面有裂纹开口，快速向内翻卷，冷后变脆。饼温60℃左右。冷榨工序工艺指标见表2。

表2 冷榨工艺指标

低温冷榨不需油料先脱皮、蒸炒、粉碎及后期复杂的净化处理，成功解决了需在低温压榨的油料压榨困难的问题，采用物理低温工艺，使得在高温下易破坏的成分得到了很好的保护，而千金子甾醇含有内酯结构，不耐高温，因此很适合低温冷榨，一次压榨后饼粕残油率为14.2%，水分质量分数为7.8%，低温冷榨明显有利于热敏性油脂的浸出。

2.2 饼粕残油率

2.2.1 提取次数的影响

由图2可知，随提取次数的增加，饼粕中的残油率也下降，但提取3次和4次饼粕中的残油率无明显变化。冷榨饼粕由于采用压力较高的冷榨机压榨，形成的饼粕质地致密，分子间孔隙很小，溶剂难于渗入，难于浸出有效成分，必须增加提取次数，考虑到饼粕中残油率不太高，因此采用3次提取即可。

图2 提取次数的影响

2.2.2 提取时间的影响

由图3可知，随提取时间的延长，饼粕中的残油率也下降，但下降的不明显。冷榨饼粕中有效成分比一般物料难提出，需要较长时间的提取才能达到浓度平衡，考虑到实际情况浸取3h即可。

图3 提取时间的影响

2.2.3 饼粕含水量的影响

由图4可知，随饼粕含水量的增加，饼粕中的残油率也略有增加，但很微弱。一般认为原料中含水量越大，用低极性溶剂提取时对浸出物含有较大影响，然而本试验发现饼粕水分对浸出影响甚微，而且若在压榨中物料湿度过低，会增加物料黏度，反而对浸出不利，因此饼粕的含水量对提取的影响可不考虑。

图4 饼粕含水量的影响

2.3 萃取与反萃取工艺

正交试验结果见表3。

表3 L9（34）正交试验表

由表3可知，影响因素的主次分别为：A→D→C→B，最佳工艺成为：A3B3C3D3。即：3倍量（V／V）石油醚60℃下萃取0.5h，萃取3次。在此工艺下进行了3次工艺验证，残液中残油率分别为：1%，2%，3%，平均残油率为2.1%。

2.4 柱色谱工艺

由表4可知：以中性氧化铝为填料，洗脱液中有效成分及回收率均高于基他填料，硅胶稍次之，但由于氧化铝再生较困难，实际选择硅胶。柱色谱中分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的选择，但是色谱填料的选择范围很宽，要做合适的选择。

表4 不同填料的影响

由表5可知，石油醚∶乙酸乙酯 ＝3∶1（V／V）的流动相的极性较大，洗脱液中杂质较多，因此千金子甾醇含量较低，但极性较大，洗脱充分，因此，回收率较高。石油醚∶乙酸乙酯 ＝5∶1或6∶1（V／V）的流动相极性较小，洗脱时间较长，而且对千金子甾醇无法有效洗脱，因此，不仅千金子甾醇的含量低，而且回收率也低。石油醚∶乙酸乙酯 ＝4∶1（V／V）的流动相对于洗脱千金子甾醇来说，极性合适，洗脱液中千金子甾醇的含量高，回收率也高，是很好的洗脱液。

表5 不同流动相的影响

由表6可知，流速越大，洗脱液中千金子甾醇含量降低，回收率降低。由于流速加大，有效成分还没来的及洗脱，洗脱液已流出，不但洗脱效果不好，而且会浪费大量洗脱液，但洗脱时间较短。流速太低，虽然有效成分能很好洗脱，洗脱液用量也少，但洗脱时间很长。从表6中可知流速为5 mL／min时洗脱液中千金子甾醇含量较高，而且回收率高，因此选择流速为5 mL／min。

表6 不同流速的影响

由表7可知，色谱柱的高径比越大，即属于“细而长”的柱子，各种成分随洗脱液的流动能在柱中有效的分开，形成不同的色谱段，分离效果较好，但分离时间很长。色谱柱的高径比越小，即属于“短而粗”的柱子，各种成分随洗脱液的流动不能在柱中很好的分开，各种成分易交叠在一起，无法有效分离。从上表可看出，色谱柱的高径比为25时较好。

表7 不同高径比的色谱柱影响

由表8可知，柱温是一个重要的操作变数，直接影响分离效能和分析速度。柱温对组分分离的影响较大，提高柱温使各组分的挥发靠拢，不利于分离，所以，从分离的角度考虑，宜采用较低的柱温。但柱温太低，被测组分在两相中的扩散速率大为减小，分配不能迅速达到平衡，峰形变宽，柱效下降，并延长了分析时间。选择的原则是：在使最难分离的组分能尽可能好的分离的前提下，尽可能采取较低的柱温，但以保留时间适宜，峰形不拖尾为度。具体操作条件的选择应根据不同的实际情况而定。柱温越高，出峰越快，保留时间越短，有些组份可能分离度不够.无法完全分开。本试验采用25℃柱温。

表8 不同柱温的影响

3 结论

千金子种子中含有丰富的油脂，利用冷榨制油，入榨温度以及压榨过程中料温较低，有效地保护了热敏性物质—千金子甾醇，废除了传统的利用低极性溶剂提取油脂的方法，减少了环境污染。饼粕残油量较少，可用少量的溶剂提取，极大地减少了有机溶剂的用量.最佳榨油工艺参数为：榨油机转速12 r／min，物料水分在7.2%。该法污染少，能耗低。饼粕最佳提取工艺为：等量石油醚（60～90℃）在60℃下提取2次，每次3 h，经冷处理饼粕残油率仅达2.1%，粗油的萃取，考虑了萃取剂用量，萃取时间，萃取温度，萃取次数4个因素考察对象，采用了L9（34）正交试验设计进行了优化，最佳萃取工艺为：3倍量（V／V）石油醚60℃萃取0.5 h，萃取2次。柱层析以硅胶为填料，对层析中的各种影响因素进行了分析，最桂层析条件为：层析柱高径比25∶1，填料为硅胶，流动相为石油醚：乙酸乙酯 ＝4∶1（V／V），流速5 mL／min，室温下层析，千金子甾醇质量分数达99.4%，收率达0.96%。

［1］郑飞龙，罗跃华，魏孝义，等.千金子中非萜类化学成分的研究［J］.热带亚热带植物学报，2009，17（3）：298－301

［2］李英霞，孙兆祥，李岩，等.毒性中药千金子研究概况［J］.中华中医药杂志，2008，23（7）：614－616

［3］孙付军，宋卫国，李英霞.千金子及不同含油量千金子霜急性毒性比较［J］.中国药物警戒，2011，8（1）：20－23

［4］危文亮，金梦阳，马冲.续随子油脂肪酸组成分析［J］.中国油脂，2007，32（5）：70－71

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［7］房子婷，付建明，梁晓军.千金子美白祛痘霜的制备及疗效观察［J］.医药世界，2007，2：105－106.