烟草根系分泌物的GC-MS检测

于会泳 ，申国明， 高欣欣,2

1中国农业科学院烟草研究所/农业部烟草生物学与加工重点实验室，青岛，266101；2中国农业科学院研究生院，北京100081

烟草不宜连作已成共识，连作不但对烟叶的产量和品质产生重要的不良影响[1]，也对土壤质量产生重要的不良影响[2-4]。化感物质被认为是造成连作障碍的重要因素，可通过影响植物生长发育的生理生化过程达到促进或损害作用。根系分泌物是化感物质的重要来源。有关根系分泌物中化感物质的鉴定已在其他作物有较多研究，如大蒜[5]、黄瓜[6]、辣椒[7]等，在烟草上的研究较少。王科等研究表明根系分泌物对烟草种子的发芽势与对照相比呈极显著差异（P＜0.01），但对莴苣和烟草种子发芽率的影响不显著，但从外观来看，处理的叶片比对照小[8]；郭亚利研究了烤烟品种K326根系分泌物中的碱溶性、酸溶性和中溶性三种组分对种子发芽率的影响，结果表明三种组分均对种子发芽率有抑制作用，其中酸溶性组分抑制作用最强，其次为中溶性组分，最后为碱溶性组分[9]，但中溶性组分对幼苗根系活力抑制作用最强[10]；我们研究了中烟100根系分泌物的三种组分对种子发芽势和发芽率的影响，结果表明三种组分也均具有抑制性作用，且呈显著性差异，对发芽势和发芽率的影响大小依次为：中溶性组分＞酸溶性组分＞碱溶性组分。以上研究表明烟草根系分泌物组分因品种不同会有一定的差异，并能确定烟草根系分泌物中存在化感(自毒)物质，但具体种类至今未有相关的研究报道。因为烟草连作障碍具有普遍性，所以具有化感作用的根系分泌物种类应同时存在于所有品种中，基于这一思路本研究分析了NC89和K326两个品种中共有的根系分泌物种类，初步确定了对烟草具有化感作用的根系分泌物。

1 材料与方法

1.1 供试品种

选用山东烟区两个主栽烤烟品种NC89和K326。

1.2 实验方法

1.2.1 幼苗砂培

实验于2010年12月-2011年5月在中国农业科学院青岛烟草资源与环境野外科学观测试验站进行。10%的盐酸浸泡石英砂后，用水冲洗至无氯离子且pH稳定为止，采用托盘育苗法进行常规育苗，幼苗大十字期时选择生长一致的幼苗进行移栽。每天浇营养液200 mL；参试营养液组成如下(单位均为g/L)：Ca(NO3)2，1.90；NH4H2PO4，0.24；Mg(SO4)﹒H2O，0.98；K2SO4，1.029；CaCl2，0.894；KNO3，1.22；H3BO3，1.90；MnCl2·4H2O，1.8；ZnSO4·H2O，0.22；CuSO4·5H2O，0.08；H2MoO4·4H2O，0.09；EDTA-Fe。

1.2.2 烤烟根系分泌物的收集提取

移栽后培养40天，每个品种完整取出生长一致的2个植株，分别放入500 mL去离子水中培养（每24h更换收集一次去离子水），连续收集2d，两天收集液混合，共2L。收集液过滤后用乙酸乙酯萃取。方法为：取定量过滤后的收集液用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相为中性组分；将剩余水相用1 mol/L HCl调节pH至2.0后，再用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相为酸性组分；将剩余水相再用1 mol/L NaOH调节pH为8.0，用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相为碱性组分，将酸性、碱性和中性乙酸乙酯萃取液分别减压浓缩至1 mL(45℃)，过0.45μm滤膜[11]。

1.2.3 根系分泌物的硅烷化处理

将乙酸乙酯萃取后的上述浓缩样品中分别加入0.25 mL硅烷化试剂(BSTFA:TMC=5:1)，加盖密封后于80℃水浴中衍生2 h，待测。

1.2.4 GC-MS分析条件

硅烷化后的各组分根系分泌物采用Agilent7890A-5975C测定。采用电子轰击源，轰击电压70eV，扫描范围M/Z 30-600 amu，扫描速度0.2 s扫全程，离子源温度230℃。毛细管柱：HP-5MS柱 (30 m × 0.25 mm,0.25 μm)，进样口温度250℃，柱温50℃(2 min)，以6℃/min程序升温至250℃(保持15 min)。载气为He，流量1 mL/min，进样量为1 μL。应用NIST98质谱数据库，分析质谱图，确定各组分物质名称。

表1 K326与NC89中性提取条件下根系分泌物主要成分比较分析

续表1

2 结果

2.1 K326与NC89中性提取条件下根系分泌物主要成分比较分析

表1为K326和NC89在中性提取条件下得到根系分泌物的种类。K326和NC89共有的组分包括4-羟基丁酸、苯甲酸、丁二酸、棕榈酸、环戊烷、二十二烷、东莨菪素、十六酰胺和硬脂酸酰胺。

K326共含有22种主要成分，其中8种有机酸，包括2-甲基乙二酸、硼酸、2-甲氧基乙二酸、4-羟基-丁酸、苯甲酸、丁二酸、肉桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸，种类数最多；酯类物质含有5种，分别为乙酸-2苯基乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、东莨菪内酯、己二酸二辛酯、邻苯二甲酸二辛酯；酰胺类物质3种，分别为十六碳酰胺、9-十八烯酰胺、硬脂酸酰胺；烷烃类物质3种，分别为十九烷、环戊烷和环十四碳烷；根系分泌物中还包含了油酸腈和4-羟基-3-甲氧基苯乙酮。

酯类物质所占的百分含量最高，为69.09%，其中邻苯二甲酸二丁酯占到了48.14%，其次为乙二酸二辛酯，百分含量为19.12%；酰胺类物质所占百分含量为8.98%；酸类物质所占比例为7.44%，其中丁二酸含量最高，为3%，其次为棕榈酸，为1.4%；4-羟基-3-甲氧基苯乙酮和油酸腈所占比例分别为0.52%和0.89%。

NC89移栽后40天根系分泌物中的主要成份中有机酸种类数最多，共16种，相对百分含量占8.47%；酯类物质包含3种，分别为邻苯二甲酸二乙酯、乙二酸二辛酯和东莨菪素，所占百分含量分别为31.17、13.07和3.02%；酰胺类物质包括2种，分别为十六酰胺和硬脂酸酰胺；烷烃类物质包括二十二烷和环戊烷；还包括甘油、烟碱、3－甲基－4－羟基苯甲醛、4－羟基－3甲氧基苯乙酮和油酸腈五种物质。

表2 K326与NC89酸性提取条件下根系分泌物主要成分比较分析

续表2

续表2

2.2 K326与NC89酸性提取条件下根系分泌物主要成分比较分析

表2为K326和NC89在酸性提取条件下得到根系分泌物的种类。两个品种共有的根系分泌物组分包括2－羟基丙酸、3－甲基－2－羟基丁酸、油酸、硬脂酸、苯甲酸、丁二酸、苯丙酸、肉桂酸、月桂酸、3－甲氧基－4－羟基苯乙酸、3，4－二羟基苯甲酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、4－羟基丁酸、邻苯二甲酸二丁酯、己二酸二辛酯、东莨菪素、环戊烷、环十四烷、油酸腈和烟碱。

K326烤烟根系分泌物共包括43种主要物质，所占比例总和为84.27%，主要成分为酸类物质，共28种，所占比例为27.28%，其中棕榈酸含量最高，为12.84%；酯类物质5种，所占比例为47.75%，其中邻苯二甲酸二丁酯所占比例最高，达到了33.04%；酰胺类物质3种，所占比例为6.76%；烷烃类物质4种，所占比例为1.23%；烟碱、4-羟基-3-甲氧基苯乙酮和油酸腈所占比例分别为0.36、0.08和0.81%。

NC89移栽后40天根系分泌物在酸性提取条件下检测到的主要组分中有机酸种类最多，共30种，所占百分含量为17.87%；酯类物质共包含6种，占59.34%，其中邻苯二甲酸二丁酯为34.73%，含量最多酰胺类物质共包括3种，分别为肉豆蔻酰胺、9-油酰胺和硬脂酸酰胺，所占比例为4.74%；烷烃类物质包括4种，分别为环戊烷、环十四烷、2，2-双（4-羟基）苯丙烷和十七碳烯，所占比例为0.83%；还包括甘油、油酸腈和烟碱，含量分别为0.17、0.65和0.12%。

表3 K326与NC89碱性提取条件下根系分泌物主要成分比较分析

续表3

2.3 K326与NC89碱性提取条件下根系分泌物主要成分比较分析

表3为K326和NC89在碱性提取条件下得到根系分泌物的种类。K326和NC89共有的根系分泌物包括月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、邻苯二甲酸二丁酯、己二酸二辛酯和环戊烷。

在碱性提取条件下，K326主要根系分泌物所占比例为87.49%，根系分泌物种类仍以有机酸类，共11种，包括2－羟基丙酸、3－羟基丁酸、4-羟基丁酸、丁二酸、月桂酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、顺－9－十六（碳）烯酸、棕榈酸、油酸和硬脂酸，所占比例为3.62%；酯类物质共7种，分别为己二酸二辛酯、乙酸-2-苯基乙酯、邻苯二甲酸二庚酯、邻苯二甲酸单乙基己基酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二乙酯和东莨菪素，所占比例为47.17%，其中邻苯二甲酸二丁酯所占比例为31.25%，乙二酸二辛酯为14.41%；酰胺类物质4种，分别为三氟乙酰胺、9－油酸酰胺、硬脂酸酰胺和十六酰胺，所占比例为35.08%；烷烃类物质包括二丁基羟基甲苯、十六烷和环戊烷，所占比例分别为0.05、0.03和0.1%；烟碱含量占0.74%；甘油和油酸腈含量分别为0.06和0.64%。

NC89移栽40天根系分泌物用碱性条件进行提取的主要种类及含量。共提取到的种类为13种，包括有机酸类、酯类、酰胺类、烷烃类和甘油，所占比例为80.93%，有机酸类包括6种，分别为硼酸、2-羟基乙二酸、棕榈酸、月桂酸、肉豆蔻酸和硬脂酸，所占比例为3.65%；酯类物质包括3种，分别为邻苯二甲酸二丁酯、己二酸二辛酯和邻苯二甲酸单（2-乙基己醇）酯，所占比例分别为51.13、19.49和3.48%；酰胺类物质包括月桂酰胺和硬脂酸酰胺两种，百分含量分别为1.4%和8.02%；烷烃类物质包括环戊烷和2,2-双（4-羟基苯）丙烷，含量分别为0.23%和0.9%；甘油含量为0.63%。

3 结论与讨论

通过对K326和NC89两个品种移栽后40天3种不同提取条件下的根系分泌物主要成分分析得出，两个品种共有的根系分泌物包括17种有机酸，分别为2-羟基丙酸、3-甲基-2-羟基丁酸、4-羟基丁酸、苯甲酸、丁二酸、肉桂酸、3-羟基苯甲酸、4-羟基苯乙酸、月桂酸、3-甲氧基-4-羟基苯乙酸、3,4-2羟基苯甲酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、9,12-十八碳二烯酸、油酸、硬脂酸、苯丙酸；2种烷烃，分别为环戊烷和环十四烷；4种酯类：邻苯二甲酸二辛酯、邻苯二甲酸二丁酯、己二酸二辛酯、东莨菪素，以及硬脂酸酰胺、甘油和烟碱。甘油、苯甲酸、月桂酸、邻苯二甲酸二丁酯、肉豆蔻酸和硬脂酸在根际土壤中也已被检测到[17]。

由于烷烃类物质不具有极性，丁二酸是三羧酸循环中一种有机酸，排除作为化感物质。目前研究公认酚酸类物质是造成连作障碍的主要化感物质，苯甲酸及其衍生物已在多种作物中被确认为化感物质，如黄瓜[6]、大豆[12]等；土壤中的对羟基苯甲酸含量随着花生连作年限的增加而增加[13]、邻苯二甲酸被认为是辣椒中的主要化感物质之一[7]；肉桂酸可抑制茄子黄萎菌孢子的萌发，当浓度为0.5 mmol·L-1时抑制作用最大[14]，茄子与烟草同属茄科，该结论有一定借鉴作用，肉桂酸对烟草的化感作用需进一步研究；棕榈酸是一种重要的化感物质[15-16]，本研究中两个烤烟品种根系分泌物中棕榈酸含量都较高，其作用机理有待深入研究，肉桂酸、月桂酸、肉豆蔻酸以及两个品种共有的酯类物质在多种作物中被证明具有化感作用。

本研究为水培条件下得到的烟草根系分泌物种类，由于土壤、尤其是根际土壤中发生着复杂的理化及生物学反应，所以在实际生产中会因土壤、栽培等条件的不同而产生多种根系分泌物种类，水培条件下得到的根系分泌物种类这些反应的物质基础。研究烟草根系分泌物的化感作用是下一步需要做的工作。

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