内质网应激与病毒性肝炎

杨丙章，任 锋，段钟平，师水生

1.山西医科大学第二临床医学院，山西 太原 030001;2.北京市肝病研究所;3.首都医科大学附属北京佑安医院

内质网(endoplasmic reticulum，ER)是哺乳细胞中一种重要的亚细胞器，是分泌性蛋白合成与折叠、蛋白质糖基化修饰、蛋白质分泌的场所，同时也是贮存和释放钙离子的场所。在生理或病理条件下，如分泌蛋白的翻译增加、折叠和蛋白酶体降解能力下降、氧化还原状态和钙离子水平的改变、ATP的耗竭以及错误的翻译后修饰都会干扰ER的稳态，将会造成未折叠蛋白在内质网内的聚集，影响内质网的正常功能，称为内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[1-2]。大量的研究证明，内质网应激能够诱导细胞凋亡，而最新的研究表明内质网应激还能够诱导炎症反应，并且影响着炎症性疾病的进展。本文就内质网应激与炎症反应的关系，以及其在病毒性乙型肝炎和丙型肝炎致病机制中作用的最新研究进展作一综述。

1 未折叠蛋白反应及其信号通路

1.1 未折叠蛋白反应 为了确保蛋白折叠的正确性以及预防非折叠或错误折叠蛋白在细胞内的聚集，抵抗内质网应激的不利作用，细胞呈现出保护性的未折叠蛋白反应(unfold protein response，UPR)，其改变细胞的转录和翻译程序以缓解内质网应激，因此一定程度的ERS能激活细胞保护机制[3]。但严重的或长时间的应激损伤内质网的功能时，则引发细胞内的凋亡，细胞死亡程序最终诱导细胞凋亡[4]。位于内质网的几种跨膜蛋白保持着内质网的稳态，监测着蛋白的折叠情况以及内质网腔结构域细胞膜的完整性，这些感应蛋白分别是Ⅰ型ER跨膜蛋白激酶(type-1 ER transmembrane protein kinase，IRE1)、双链RNA依赖的蛋白激酶样ER激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase(PKR)-like ER kinase，PERK)和活化转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)。通常情况下，这几个蛋白与内质网腔内的伴侣蛋白结合而保持着被抑制的非活性状态，尤其是葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein-78，GRP78)。在 UPR期间，GRP78从与IRE1α、ATF6和PERK的结合中分离，去结合未折叠蛋白处理其暴露的疏水区域，通过ATP水解所引起的ATP酶结构域构象变化来促进蛋白的正确折叠。GRP78脱离后释放出的 IRE1α、PERK和ATF6反而引发UPR:IRE1α和PERK通过二聚化和/或自体磷酸化而自身激活，ATF6转移到高尔基体中，通过调节性膜内蛋白水解过程而被激活[5]，它们激活后促进UPR的发生。

1.2 未折叠蛋白反应信号通路及其功能 IRE1α-XBP-1信号通过提高折叠蛋白的能力并减少蛋白生成负荷来提高蛋白折叠能力，减少未折叠蛋白。IRE1α被激活后呈现出核酶功能，剪切X盒结合蛋白1(XBP-1)mRNA，由此产生的sXBP-1通过控制ER相关降解(ER-associated degradation，ERAD)的基因启动子UPR元件而激活转录，提高折叠蛋白能力[6]。IRE1α作为核酶活性的另外一种功能是降解编码分泌性的mRNA(例如胰岛素mRNA)和膜蛋白基因，以减少新合成的、需要被折叠的蛋白质[7]。

ATF6信号通路通过调节UPR的转录以提高蛋白的折叠能力。研究发现，ATF6是一个UPR的共同激活子，可以结合几乎UPR反应基因启动子的所有元件，ATF6影响了大约 10% ～20%的 UPR调节基因[8]。经过一定的膜内蛋白水解的调节，ATF6转移到细胞核内，与内质网应激反应元件相互作用，上调伴侣蛋白/折叠酶，如 GRP78、GRP94、IRE1α、蛋白质二硫键异构酶(PDI)、ERp72、GRP58/ERp57、calnexin 和钙网蛋白等，这些蛋白都增加了内质网中的蛋白折叠能力[9]。

PERK-eIF2a信号通路减少了蛋白mRNA的翻译。激活的PERK使真核翻译起始因子2α亚基(eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α)磷酸化，从而关闭蛋白质的翻译，阻止蛋白质负荷增加，同时选择性地增加某些mRNA的翻译水平，例如ATF4，从而促进伴侣蛋白的上调[10]。此外，最近的研究表明，UPR通过诱导自噬，可能通过早期c-Jun氨基末端激酶(JNK)的激活或TOR-ATG信号通路，快速去除多余的或者受损的细胞器和细胞质成分从而保护应激细胞[11]。

综上所述，当内质网环境受到干扰，分泌蛋白或者膜蛋白积聚于内质网内，内质网应激分别通过激活IRE1α、PERK和ATF6信号通路，减少新生蛋白质负荷、增加蛋白折叠能力或者清理受损的内质网成分，从而缓解细胞的内质网应激状态。

2 内质网应激与炎症反应

越来越多的证据表明，UPR信号通路和炎症信号通路通过各种机制相互联系，包括活性氧(ROS)的产生、内质网钙离子的释放、转录因子核因子-κB(NF-κB)、有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)的激活等，因此内质网应激诱导和/或协同促进了炎症反应的发生和程度。

2.1 内质网应激促进活性氧的聚集引发炎症反应活性氧是炎症反应的重要调节子，最近的研究发现，内质网应激与细胞内活性氧的产生和聚集密切相关。在内质网中，蛋白质折叠形成正确构象是一个耗能的过程，因为氧化条件是分子内和分子间的二硫键形成所必需的。在二硫键形成的过程中，通过蛋白中转驱动电子的运输，而这涉及到位于内质网中的两种酶:蛋白质二硫键异构酶(PDI)和ER氧化还原酶1(ERO1)[12]。PDI直接接收电子，引起半胱氨酸残基氧化和二硫键的形成。ERO1依靠四羟酮醇依赖性反应将电子从PDI转移到分子氧上，从而使PDI氧化。虽然它提供了二硫键形成的强大动力，但作为终端电子接受体的分子氧的利用导致了ROS的产生[13]。因此，内质网中蛋白质折叠的负荷增加，导致ROS的积累，从而引发炎症反应。

2.2 内质网应激导致NF-κB的活化 NF-κB是一个关键的转录调节子，在炎症的发生方面起到核心作用。在缺乏炎症刺激的情况下，NF-κB通过结合NF-κB的抑制子(IκB)而保持失活状态，IκB是一种结构性表达的蛋白。NF-κB的活化过程是由信号诱导IκB的磷酸化来启动的，磷酸化的IκB随后被降解。IκB降解后暴露出NF-κB的核定位信号，使NF-κB转移到细胞核，在那里引起了许多炎症反应基因的转录。研究已经证明，内质网中蛋白质折叠负荷增加(例如在病毒感染期间)导致了NF-κB激活[14]。研究表明，利用钙离子螯合剂和抗氧化剂诱导内质网应激状态，有助于NF-κB的激活，内质网应激导致的NF-κB激活可能是由于超负荷的蛋白质折叠而引起的氧化应激和/或内质网应激相关的钙离子泄露到细胞质中所引起的[15]。此外，对于内质网应激反应，UPR可直接通过PERK-eIF2α通路介导的翻译减弱而促进NF-κB的激活:由于IκB的半衰期比NF-κB要短，逐渐衰减的翻译增加了 NF-κB/IκB 的比例，从而释放 NF-κB，在内质网应激的条件下，转移到细胞核中。这种效应已经在诱导内质网应激药物处理的细胞中，以及紫外线照射的细胞中被观察到，它们都启动了UPR的PERK激活[16]。

在哺乳动物中，IRE1α在整合内质网应激信号途径与炎症反应信号途径方面起到重要作用。在内质网应激的条件下，IRE1α自体磷酸化诱导了其胞浆域构象的变化，然后结合肿瘤坏死因子-α(TNF-α)受体相关因子2(TRAF2)。IRE1α-TRAF2复合体可以募集IκB 激酶(IKK)，其可使 IκB 磷酸化，导致 IκB 的降解和NF-κB向细胞核内的转移。与这些观察结果相一致，对于缺乏IRE1α的小鼠胚胎成纤维细胞，内质网应激诱导的NF-κB激活和TNF-α的产生被明显消弱。IRE1α-TRAF2复合体也可以募集蛋白激酶JNK，导致JNK的活化。被激活的JNK通过磷酸化转录因子激活蛋白1(AP1)而诱导炎症因子基因的表达[17]。

3 内质网应激和病毒性肝炎

3.1 内质网应激与丙型病毒性肝炎 丙型肝炎病毒感染的细胞会产生高水平病毒蛋白，这一方面引起了针对病毒蛋白的UPR，限制病毒的翻译;另一方面，为了抵抗内质网应激诱导的细胞调亡而发挥的自我保护作用使得病毒蛋白持续存在而呈现出不利作用。来自细胞培养和转基因鼠模型的证据表明，丙型肝炎病毒复制子的一些成分既诱导UPR基因的表达，也引发肝损伤。例如，在Huh-7细胞中，HCV复制子诱导了sXBP-1的表达而抑制ERAD;在表达亚基因组复制子的细胞中，HCV基因表达与ATF6从细胞质转移到细胞核中有密切关系[18]。通过上调 XBP-1的转录，ATF6激活UPR的IRE1-XBP-1信号途径，而在HCV复制子表达的细胞中，虽然XBP-1的剪切mRNA和sXBP-1蛋白升高，但 sXBP-1的反式激活活性在某种程度上在丙型肝炎病毒感染细胞中被压制，防止了内质网降解增强甘露糖苷酶样蛋白(EDEM)转录诱导并且抑制了 ERAD[19]。Joyce 等[20]动物实验研究表明，HCV 通过诱导应激及促凋亡的BAX阻止抗凋亡的NF-κB及BCL-xL的产生，使得肝细胞对凋亡更敏感，从而造成肝细胞的损害和凋亡。在细胞中表达的HCV蛋白诱导的内质网应激也可以导致钙离子从内质网中释放，从而激活cAMP反应元件结合蛋白(CREB)，激活的CREB能够上调蛋白磷酸酶2Ac(PP2Ac)，导致凋亡和肝癌的发生[21]。不仅如此，HCV核心蛋白在Huh-7或者HepG2细胞的表达可诱导C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)表达，促进 BAX转移到线粒体及细胞色素 C的释放，激活 Caspase-3和PARP的活性，促进细胞死亡[22];在HCV结构蛋白基因的转基因小鼠中，Cleaved Caspase-3和CHOP的表达增高，促进肝细胞凋亡[23]。

HCV感染细胞中引发的UPR并不能去除HCV过量的病毒蛋白;HCV复制子也同时压制UPR所产生的保护性作用，这样会导致病毒的持续产生，逃避免疫清除。例如，NS3和NS5B与内质网膜相关的核糖核蛋白(RNP)形成复合体来指导并促进病毒的复制。NS4B诱导ATF6和IRE1有利于HCV亚复制子并促进HCV病毒复制[24-25]。最新细胞研究表明，被激活的内质网应激促进了HCV的复制，其机理是因为HCV激活内质网应激，而内质网应激再激活细胞自噬体的形成，而HCV利用自噬体进行大量的病毒复制[26-27]。

然而，以上研究仅仅局限于HCV的细胞模型和转基因动物模型，这对HCV复制有很大的限制，因为这些模型中的HCV复制并不能释放出HCV颗粒，这与临床患者HCV复制特征存在较大的差异;除此以外，在丙型肝炎疾病进展过程中，内质网应激发挥着怎样的作用，目前还是一片空白。目前为止，仅有一篇文献简单介绍了内质网应激在丙型肝炎疾病进展中的作用[28]。该研究表明，未经治疗的慢性丙肝患者肝脏组织中内质网应激敏感元件ATF-6、IRE1和PERK均被激活，而三个敏感元件并不激活UPR所诱导的保护性基因，因此这与以细胞和动物模型为对象的研究结果有很大的区别。因此，以丙型肝炎患者为研究对象的内质网应激研究更具有现实意义。

3.2 内质网应激和乙型病毒肝炎 目前为止，关于乙型肝炎致病过程中内质网应激的国外研究不多，仅仅局限于HBV的细胞模型研究，国内研究报道也寥寥无几。体外细胞研究结果表明，当感染HBV后，HBV表面抗原的大、中、小3种形式的包膜蛋白中，大表面蛋白过表达，使大、中、小蛋白的比例不能达到恰当水平，三者无法结合成可分泌的病毒颗粒，结果是一方面导致亚病毒和病毒颗粒的分泌受阻而积聚，造成肝细胞的毛玻璃样变性和以及对细胞炎性因子的高敏感性，从而造成肝脏实质损伤，另一方面变异蛋白的表达还会妨碍内质网内正常可折叠蛋白的活性，进一步促进UPR[29-30]。HBV 的 HBX(hepatitis B virus X)蛋白是一种多功能的调节器，可诱导内质网应激的发生。HBX蛋白一方面诱导未折叠蛋白反应的ATF-6和IRE1-XBP1信号途径诱导内质网应激;另一方面通过内质网应激诱导ATF-4促进环氧合酶2的表达，从而促进炎症反应的发生[31]。在细胞中表达的HBV蛋白诱导的内质网应激也可以导致钙离子从内质网中释放，从而激活cAMP反应元件结合蛋白(CREB)，激活的CREB能够上调蛋白磷酸酶2Ac(PP2Ac)，进一步削弱细胞循环的调节导致凋亡和肝癌的发生[21]。此外，HBX降低参与线粒体脂肪酸β-氧化及线粒体内膜电位酶的表达，因HBX引起的ATP水平的降低通过eIF2α/ATF4通路诱导未折叠蛋白反应以及COX2表达[32]。其他研究也证明 HBX诱导 UPR，是 ATF6及IRE1-XBP1通路的重要激活物:HBX介导的这些通路可能促进HBV在肝细胞中的复制和表达，从而引起肝病甚至可能促进肝癌的发生[33]。

4 小结

在丙型病毒性肝炎和乙型病毒性肝炎疾病进展中，内质网应激发挥着重要的作用，而未折叠蛋白反应则可缓解内质网应激引起的损伤，起到一定的保护作用，但过度的内质网应激发生可引起炎症反应和细胞凋亡，从而对宿主造成伤害。目前丙型病毒性肝炎研究较多，而乙型病毒性肝炎的研究较少，尤其在临床患者研究方面关于两者研究均甚少，并且内质网应激在两者发病中的详细机制仍不明了。因此内质网应激在乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒致病进展中的作用及机制研究是我们今后的研究方向之一。

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