徐雪梅,王巧民,宋继中,代子艳
1.安徽省立医院消化内科,安徽 合肥 230001;2.阜阳市第一人民医院消化内科
诸多研究包括流行病学、临床试验以及动物实验都证明了感染对肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)的发生发展有重大影响,但其确切机制还不明确。由于在IBS患者中不易获取肠组织,取材的深度和大小均受到局限,并且涉及到人体实验的伦理学问题,建造模拟IBS发病的动物模型进行研究无疑十分重要。目前有关肠道感染和IBS关系的研究在动物实验方面,国内外都有了一定的研究。但是用于实验的病原体多数是旋毛虫、线虫等寄生虫,用细菌进行研究的较少,而实际上与感染后肠易激综合征(postinfectious irritable bowel syndrome,PI-IBS)有关的病原体多是细菌。当前用细菌制造PI-IBS动物模型的方法国内外比较成功的还很少见[1-2]。因此制造PI-IBS肠道细菌感染的动物模型很有必要性且具有可行性。本研究目的:用福氏志贺菌感染大鼠,制作感染后大鼠肠功能紊乱模型,以肠道急性感染消失,即病原学培养无致病菌生长,病理组织学显示结肠组织无固有层中性粒细胞的浸润和间质水肿;出现内脏高敏感性伴有或不伴有肠道运动功能异常,作为感染后肠功能紊乱动物模型建立成功的标准[1-5]。
1.1 实验动物及分组 由武汉疾病控制中心提供wista大鼠,饲养条件Ⅱ级,雄性,体质量180~210 g。称重编号后随机分为实验组和对照组。
1.2 细菌 福氏4型志贺菌由安徽医科大学微生物教研室提供。
1.3 肠功能紊乱大鼠模型的建立 大鼠被随机分为感染组和对照组,每组20只。感染组予2 mL的5×109cfu/mL福氏志贺菌灌胃,对照组予2 mL的生理盐水灌胃。灌胃后每天观察大鼠的排便情况,并后于灌胃后第1天、第3天、第14天、第21天进行大便培养,连续培养2次及以上阴性的继续下面的实验,否则撤出实验。内脏敏感性的测定于灌胃后的第21天、42天、63天进行。上述实验结束后将大鼠全部处死,取回肠和结肠标本进行病理学检查,观察肠道的炎症情况。
1.4 模型成功的判断方法 (1)大鼠大便性状观察:灌胃后每天观察大鼠的排便情况。大便性状采用Bristol分级[6]。其中1~2级表示便秘,3~4级表示正常,5~7级表示有腹泻。按照分级标准分别将1~7级赋值为1~7分,对大鼠大便性状进行评分。(2)大便4型福氏志贺菌培养情况:于灌胃后第1、3、14、21天行大便培养,培养方法:取大鼠大便适量,性状改变者取黏液、脓血部分,接种于SS培养板,37℃温箱内培育18~24 h,挑取无色半透明可疑菌落,作生化反应,如果葡萄糖反应(+),乳糖反应(-),蔗糖反应(-),种半固体显示动力(-),初步鉴定结果为福氏痢疾杆菌,再进行血清学鉴定,即福氏4型血清凝集,证明大便培养福氏4型志贺氏痢疾杆菌培养(+),否则为志贺氏痢疾杆菌培养(-)。连续2次或2次以上阴性继续下面的实验。(3)内脏敏感性测定:在灌胃造模后第21天、42天、63天,采用直肠球囊扩张(colorectal distension,CRD)的方法观察大鼠腹部回撤反射(abdominal withdrawal reflex,AWR)。实验前,禁食不禁水24 h,以减少粪便形成,并于实验前轻触肛门,使其排除残余粪便。将Braun10F导尿管石蜡油润滑后,插入直肠,使气囊尾端距肛门1 cm,用4号手术线固定于鼠尾根部,将大鼠放入透明的鼠固定器内,使其四肢不能活动,但是能观察其腹部回撤反射。大约30 min后,大鼠适应环境后开始注入常温(26~28℃)生理盐水,从0.1 mL开始,以每次0.1 mL的梯度递增,使球囊内压力逐渐升高。分别观察引起大鼠腹部抬起以及背部拱起的容量阈值,进行评估。每次间隔30 min,重复进行3次扩张,取均值。采用直肠扩张时AWR[7]评分。记录引起评分为3分和4分时两个行为学反应的最小容量阈值。(4)组织形态学:水合氯醛麻醉大鼠,剖腹手术分离末端回肠(距回盲部5 cm)和近端结肠(回盲部下3 cm),用盐水冲洗。所有标本组织经10%甲醛固定,常规石蜡包埋,4 μm厚连续切片,进行HE染色,染色结果均由两位病理医师阅片诊断核实,观察肠黏膜固有层有无中性粒细胞浸润及间质有无水肿。具体评分如下:轻度:固有层少量中性粒细胞浸润,轻度或无间质水肿;中度:固有层中等量中性粒细胞浸润,间质中度水肿;重度:中量到大量中性粒细胞浸润固有层,严重间质水肿。
1.5 统计学分析 应用SPSS 11.5软件进行统计学分析,两组间比较采用独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 大便培养 实验组大鼠于急性感染后第1天,大便4型福氏志贺菌培养结果阳性,第3天有16只大鼠培养阳性,至第14天及第21天,大便致病菌培养均为阴性,至实验即将结束时的最后一次培养亦为阴性。正常对照组大鼠大便致病菌培养始终阴性。
2.2 大便性状的观察 对照组大鼠在整个实验期间大便性状无明显改变。感染组在灌胃后第1~2天开始出现粪质稀薄,少数伴有黏液便,第3~4天症状最为明显,Bristol分级评分为5.20 ±0.42,对照组分级评分为3.6±0.52,两组间差异有统计学意义(P<0.05),第7天症状减轻,所有大鼠第10天症状基本消失。在第21天进行第一次内脏敏感性测定后,感染组大鼠再次出现粪便形状不规则伴有黏液,此后有18只大鼠一直间断有黏液便直到实验结束,另外2只大鼠很快大便又恢复正常。
2.3 肠道感染对大鼠内脏感觉功能的影响 在感染后的第21天、42天、63天,大鼠腹部抬起(AWR评分3分),弓背(AWR评分为4分)的容量阈值较对照组均明显降低(P<0.05)(见表1和表2)。然而将感染组大鼠在上述3天内腹部抬起和弓背的最小容量阈值进行比较,差异无显著性(P>0.05)。
表1 AWR评分为3分时的容量阈值比较(,mL)Tab1 Comparison of the threshold at 3 points of the AWR(,mL)
表1 AWR评分为3分时的容量阈值比较(,mL)Tab1 Comparison of the threshold at 3 points of the AWR(,mL)
分组 第21天 第42天 第63天感染组2.26 ±0.17 2.28 ±0.18 2.23 ±0.211.04 ±0.24 1.07 ±0.19 1.12 ±0.15对照组
表2 AWR评分为4分时的容量阈值比较(,mL)Tab2 Comparison of the threshold at 4 points of the AWR(,mL)
表2 AWR评分为4分时的容量阈值比较(,mL)Tab2 Comparison of the threshold at 4 points of the AWR(,mL)
分组 第21天 第42天 第63天
2.3 组织学检查 HE染色两组大鼠末端回肠和近端结肠未见明显组织损伤,切片显示未见明显中性粒细胞浸润,间质无明显水肿,属于轻度。
当前模拟PI-IBS发病的动物模型多是以炎性介质或是寄生虫感染作为诱发因素,而临床上PI-IBS的发病多是在细菌感染后,而且在我国急性胃肠炎的病原体以痢疾杆菌中的福氏志贺菌最为多见,目前国内仅有个别报道福氏志贺菌感染比较成功的大鼠模型[1],因此进一步研究4型福氏志贺菌作为致病菌来诱导PI-IBS动物模型,并研究其发病机制很有必要。
采用4型福氏志贺菌造模,在造模中采用的是2 mL 5×109cfu/mL给大鼠进行灌胃,与国内研究[2]中细菌菌量不同,我们考虑与细菌在不同培养环境下的毒力不同有关,比如在普通培养基中细菌的毒力会低于肉汤培养基中的毒力,而我们采用的细菌是在普通培养基中生长的。在实验中我们采用给对照组大鼠灌入同等量的生理盐水作为对照,感染组大鼠在灌胃后第1~2天后出现大便性状改变,并且大便培养致病菌阳性,而对照组大便正常,大便培养阴性,说明感染成功。
由于IBS的诊断是基于症状的诊断,缺乏生物学标准,因此造成动物模型评判标准无法统一,现有的动物模型还不能将IBS同其他的功能性疾病进行区分。因此,目前还没有理想的研究IBS的动物模型。早先的研究认为对肠腔扩张刺激的敏感性增加是IBS患者的共同特征之一[8-9]。内脏高敏感性被认为是IBS的基本特征[10]。因此,当前关于IBS的动物模型多以内脏敏感性增加作为IBS动物模型成功的标志。我们在实验中测定大鼠内脏敏感性的方法是采用了应用最为广泛的即通过对大鼠进行CRD,观察大鼠AWR的方法,每次刺激间隔30 min,重复3次进行。我们选用了AWR评分中改变最客观也最易观察的两个大鼠行为学反应,即腹部抬离桌面和弓背,由非实验人员进行AWR评分,最大限度地减少主观原因造成的偏差。之所以选择感染后第21天开始进行内脏敏感性的测定,是因为文献记载感染后急性炎症消失一般在第3~4周左右[1-5]。此后我们每隔3周重复进行内脏敏感性的测定,是为了观察其内脏敏感性是否持续增高。
本实验中用福氏志贺菌感染大鼠后,在急性期大鼠出现大便性状的改变,并且经大便培养确定感染成功,此后连续2次培养阴性后,大鼠仍有反复持续的大便性状改变,伴有内脏敏感性持续而显著的增高,病理切片显示在末端回肠及近端结肠均无明显中性粒细胞浸润及间质水肿,说明感染后大鼠肠功能紊乱模型成功。并且大鼠大便性状改变和内脏敏感性增加持续到感染后9周,说明感染后大鼠具有感觉和动力的双重障碍,更加符合肠功能紊乱慢性复发性的特点,更贴近于IBS的临床特点。
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