电离辐射对食管癌细胞系(ECA109和TE13)r-H2AX表达的影响

史鸿云，祝淑钗，卢付河，王玉祥，何 丽

(1.河北大学附属医院放疗科，河北保定071000;2.河北医科大学第四医院放疗科，河北石家庄050017)

维持一个完整的基因组对于细胞的稳定性是至关重要的，由电离辐射和类辐射药物产生的DNA 双链损伤是最主要的细胞毒损伤，如果不能修复这种损伤就会导致基因组不稳定和肿瘤的形成或其他年龄相关疾病［1］。体内外的研究都证明H2AX 的修饰在调节各种细胞应答DNA 双链断裂中起着中心作用［2－4］。Giunta 等的实验为rH2AX 作为DNA 双链断裂的标志提供了证据［5］。而食管癌ECA109 为高分化鳞状细胞癌，TE13 细胞为低分化鳞状细胞癌，他们的生物学特征不同，研究r-H2AX 在不同食管癌株系的动力学特点将有助于了解DNA 双链断裂——这一细胞内最致命的损伤的特点与食管癌放疗敏感性之间的关系。

1 材料与方法

1．1 材料

1.1.1 细胞系:ECA109 和TE-13 食管癌细胞系由河北医科大学附属第四医院科研中心提供。

1.1.2 细胞培养:细胞贴壁生长玻璃培养瓶，加入RPMI-1640 培养基，置5% CO2饱和湿度的培养箱中培养，每2 ～3天传代1 次。

1.1.3 细胞照射:采用6MV-X 射线治疗机，照射野20 cm ×20 cm，源皮距100 cm，培养瓶下置5 cm组织补偿膜，机架角180 度，室温条件下照射。

1．2 方法

1.2.1 蛋白样品提取:对数生长期的ECA109:细胞和TE13细胞，用6MV-X 射线照射0、1、2、4 和8 Gy，照射后0.5、1、2、4、8、12 和24 h按照蛋白提取试剂操作步骤提取细胞总蛋白，考马斯亮蓝法蛋白定量，－20 ℃保存备用。

1.2.2 Western blot 检测:不同食管癌细胞系不同剂量不同时间r-H2AX 的表达。根据Western blot 法测定各条带的平均吸光度值，以吸光度值代表蛋白的相对表达量。

1．3 统计学分析:采用SPSS16.0 进行统计学分析，结果以均数±标准差(±s)表示。

2 结果

2.1 ECA109 细胞接受不同剂量照射后r-H2AX 随时间变化特点(图1)。

ECA109 细胞未照射时有一定的本底表达，在接受1 Gy和2 Gy照射后r-H2AX 2 小时达到峰值，12 h内恢复到本底水平。接受4 Gy和8 Gy照射后r-H2AX 1 h达到峰值，24 h内恢复到本底水平(图1)。表1 为图1 的统计结果。

2.2 TE13 细胞接受不同剂量照射后r-H2AX 随时间变化特点(图2)。

TE13 细胞的结果显示未照射时r-H2AX 有一定量的表达，接受照射后随着受照射剂量的增加r-H2AX 的表达量到达最大量的时间提前，并且r-H2AX 在24 h内均不能恢复到放疗前水平(图2)。表2 为图2 的统计结果。

3 讨论

本实验中将两个同源细胞系进行比较，发现r-H2AX 表达有共性也有区别。相同之处在于1)两种细胞系都存在一定量的r-H2AX 本底表达量。2)随着接受电离辐射剂量的增加r-H2AX 表达量峰值的时间提前。这一点与文献［6］的结果相似。不同之处在于TE13 细胞内r-H2AX 衰退的时间远远大于ECA109 细胞，也就是说DNA 双链损伤多，说明低分化鳞癌对射线敏感。

总之，应答电离辐射产生的r-H2AX 是细胞系依赖的，本实验中两种不同分化的同源食管癌细胞表现出对放射线较敏感的TE13 细胞到达峰值的时间较长但衰退时间更长。这一特点与文献［6］的结果相似。为了更深入的阐明r-H2AX与固有放射敏感性之间的关系，将来要扩展细胞系的种类，也许不远的将来，可以用细胞接受电离辐射后产生的r-H2AX 的动力学特点来评估细胞或肿瘤组织的放射敏感性，为肿瘤治疗前进行治疗手段的筛查做出贡献。

表1 统计学分析ECA109 接受不同剂量辐射后rH2AX 蛋白表达随时间变化特点Table 1 Analysis of the express of r-H2AX with time after different radiation dose in ECA109(±s)

表1 统计学分析ECA109 接受不同剂量辐射后rH2AX 蛋白表达随时间变化特点Table 1 Analysis of the express of r-H2AX with time after different radiation dose in ECA109(±s)

*P＜0.05 compared with 0 hour．

dosage00.5 hour1 hour2 hours4 hours8 hours12 hours24 hours 1 Gy1.11 ±0.011.14 ±0.261.41 ±0.22*1.74 ±0.24*1.27 ±0.18*1.23 ±0.080.76 ±0.14*0.69 ±0.27*2 Gy1.08 ±0.141.16 ±0.471.72 ±0.34*1.83 ±0.18*1.58 ±0.03*1.28 ±0.21*0.88 ±0.08*0.77 ±0.29*4 Gy1.06 ±0.221.21 ±0.091.84 ±0.29*1.92 ±0.21*1.78 ±0.2*1.32 ±0.23*1.13 ±0.160.98 ±0.16 8 Gy1.12 ±0.161.62 ±0.13* 2.74 ±0.15*2.12 ±0.28*1.83 ±0.28*1.65 ±0.15*1.38 ±0.26*1.2 ±0.29

表2 统计学分析TE13 接受不同剂量辐射后rH2AX 蛋白表达随时间变化特点Table 2 Analysis of the express of r-H2AX with time after different radiation dose in TE13(±s)

表2 统计学分析TE13 接受不同剂量辐射后rH2AX 蛋白表达随时间变化特点Table 2 Analysis of the express of r-H2AX with time after different radiation dose in TE13(±s)

＊P＜0.05 compared with 0 hour．

dosage00.5 hour1 hour2 hours4 hours8 hours12 hours24 hours 1 Gy0.71 ±0.070.81 ±0.141.01 ±0.31*1.32 ±0.35*1.68 ±0.34*1.75 ±0.38*3.90 ±0.36*1.75 ±0.31*2 Gy0.64 ±0.121.14 ±0.12* 1.19 ±0.38*1.51 ±0.38*2.65 ±0.38*2.21 ±0.33*2.14 ±0.30*1.94 ±0.25*4 Gy0.69 ±0.151.25 ±0.18* 1.66 ±0.17*2.31 ±0.19*2.13 ±0.22*1.66 ±0.16*1.72 ±0.13*1.99 ±0.18*8 Gy0.72 ±0.191.54 ±0.10* 2.41 ±0.11*2.16 ±0.15*2.11 ±0.09*3.38 ±0.15*4.78 ±0.16*7.82 ±0.32*

图2 Western blot 检测TE13 细胞接受照射后r-H2AX 随时间的表达Fig 2 The express of r-H2AX with time after different radiation dose through Western blot in TE13

［1］Jackson SP，Bartek J．The DNA-damage response in human biology and disease［J］．2009，22，461:1071－1078．

［2］Celeste A，Fernandez-Capetillo O，Kruhlak MJ，et al．Histone H2AX phosphorylation is dispensable for the initial recognition of DNA breaks［J］．Nat Cell Biol，2003，5:675－679．

［3］Fernandez C，Lee A，Nussenzweig M，et al．H2AX:the histone guardian of the genome．DNA Repair［J］Amst，2004，3:959－967．

［4］Bonner WM，Redon CE，Dickey JS，et al．GammaH2AX and cancer［J］．Nat Rev Cancer，2008，8:957－967．

［5］Giunta S，Beloteserkovskaya R，Jackson SP．DNA damage signaling in response to double-strand breaks during motosis［J］．Cell Biol，2010，26，190:197－207．

［6］Mahrhofer H，Burger S，Oppitz U，et al．Radiation induced DNA damage and damage repair in human tumor and fibroblast cell lines assessed by histone H2AX phosphorylation［J］．Int J Radiat Oncol Biol Phys，2006，64:573－580．