线粒体对iPSC再程序化的影响

贺文凤，曹 青，洪 葵，2*

(南昌大学第二附属医院1．江西省分子医学重点实验室;2．心血管内科，江西南昌330006)

自首次报道经携带OCT4、SOX2、KLF4 及C-MYC基因的4 种反转录病毒共同转染人皮肤成纤维细胞并成功建立人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)系以来，有关iPSC 的研究急剧增加，目前已建立多种疾病特异的iPS 细胞系［1－3］。研究表明，直接将体细胞再程序化成为iPSC获得患者特异的干细胞系能够真实地再现疾病的发生过程，为研究疾病的发病机制、药物筛选提供了良好的体外研究模型。另外，iPS 的遗传学特征与其来源的体细胞一致，由其分化来的组织或器官移植到患者体内不容易产生免疫排斥，因而具有实现个体化的优点，从而为组织替代治疗提供了独特的机会，给再生医学带来了新的希望，并且避免了人胚胎干细胞带来的伦理学问题。目前iPS 细胞来源的体细胞范围非常广泛，不但可以来源于成纤维细胞，还可以来源于体内其他已经分化的细胞。在iPS 产生技术上已经利用非整合性病毒、小分子化合物或蛋白质等新方法成功地建立了iPS 细胞系，从而有利于提高iPS 的形成效率并减低肿瘤的发生。尽管iPS 技术取得了迅速的发展，但由于细胞内重编程过程的复杂性，使得体细胞经过再程序化成为iPS 是一个缓慢的并且随机发生的过程，iPS 技术上仍然存在许多需要解决的问题，从而阻碍了其实际应用。体细胞重编程为iPSC 的难题突出表现在两个方面:一方面是减少再程序化过程导致的细胞凋亡及衰老;另一方面是提高体细胞获得多能性的效率。

1 线粒体的功能及其在iPSC 再程序化过程中的作用

线粒体由外膜、内膜、膜间隙和基质4 部分组成，具有通过电子传递链控制ATP 的产生、控制细胞内钙离子稳态及细胞凋亡和信号传导的功能。同时，线粒体也是导致DNA 氧化损伤的内源性活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的主要来源。线粒体具有自身的DNA，线粒体DNA 的复制由聚合酶gamma 等核因子调控，有效地控制线粒体的数量及功能对于维持细胞内能量生成及抗氧化损伤非常重要，但由于ROS 的存在并缺乏有效的修复机制，线粒体DNA 随细胞寿命增加易于发生突变，导致细胞功能障碍。线粒体参与了细胞的许多重要的生理过程，已有许多研究表明线粒体的结构及功能对干细胞的生存、增殖、自我更新及分化潜能具有重要影响［4－6］。

2 线粒体对iPSC 再程序化过程中能量转化的影响

含氧量正常的生理状态下，人的体细胞以活化的线粒体及需氧代谢为特征，而胚胎干细胞则以糖酵解为能量代谢特征，糖酵解能够提供快速的能量供应并避免ROS 的产生，并通过促进戊糖磷酸旁路途径抗氧化。早期研究表明，低氧及线粒体抑制剂能减少胚胎干细胞分化，同时维持其多能性及自我更新的能力，因而将相对非成熟的线粒体结构及低线粒体活性作为原始胚层细胞、内细胞团、早期胚胎及人和鼠胚胎细胞的共同特征［7］。

但是，iPSC 采用什么样的能量代谢方式，线粒体与再程序化又有什么样的联系?新近研究提出了一些新思路。研究发现在干细胞因子重编程体细胞的过程中，线粒体也发生重编程回复到类似胚胎干细胞的状态，由成熟的管状嵴富集的体细胞线粒体转变为非成熟球形嵴缺乏的类胚胎干细胞线粒体，并具有线粒体数目少、集中分布于细胞核周围、线粒体DNA 拷贝数少等胚胎干细胞内线粒体的典型特征，并且发现糖酵解代谢有利于iPSC 处于自我更新状态［8－10］。2011年有研究比较了ESC、iPSC 及产生iPSC 的相应体细胞的能量代谢方式，并对与葡萄糖代谢相关的几条通路的基因及调控葡萄糖代谢的关键蛋白进行了分析。结果表明，尽管iPSC 的代谢特征不完全与ESC 一致，但是，其与ESC 的相似性远远大于其相应的体细胞［11］。同年另一研究小组在CELL 杂志发表了关于能量代谢在iPSC 产生中的作用，证实了体细胞经过再程序化形成iPSC 过程中线粒体的形态变化，并通过蛋白组学足迹法及指纹法发现iPSC 的代谢不同于其来源的体细胞，iPSC 的葡萄糖利用增加，细胞内外糖代谢产物乳酸盐及醋酸盐增加，能量代谢由体细胞的氧化磷酸化转化与胚胎型一致的糖酵解代谢(图1)。更为让人欣喜的发现是在体细胞去分化的过程中，糖酵解基因在诱导再程序化处理后1 周表达，而多能性基因在2 周后才开始表达，刺激糖酵解能提高体细胞再程序化的效率。细胞内糖酵解酶表达增加，电子传递复合体Ι 表达降低使得能量代谢模式由氧化代谢转变为糖酵解代谢是获得多能性的基础［12］。一些小分子或线粒体抑制剂能够通过调节线粒体的动态平衡使线粒体被自噬体清除，使线粒体丧失，从而加速糖酵解代谢，有利于再程序化的进行［12－13］。

干细胞转录因子重编程体细胞获得胚胎样的多能性是iPSC 的标志，而体细胞的能量结构转化是成功获得干细胞性的关键。线粒体与细胞的能量代谢有着密切的联系，细胞中除糖酵解在细胞质中进行外，其他的生物氧化过程都在线粒体中进行。作为再程序化的结果，线粒体DNA 的减少与线粒体形态的不成熟具有一致性，非线粒体依赖的代谢是体细胞再程序化的基础。调节线粒体的生物合成，从而转换细胞内的能量代谢模式对体细胞获得干细胞性重编程为iPSC 以及iPSC 维持自我更新和多能性是必须的。

3 线粒体对iPSC 再程序化过程中细胞衰老的影响

在体细胞内表达4 种干细胞因子是一个造成细胞损伤的过程，这个过程有可能激活细胞衰老从而阻碍iPSC 的再程序化进程，而线粒体对其有什么样的影响，受到什么因素的调控?

图1 体细胞重编程为iPSC 的过程中，能量代谢由氧化磷酸化为主的方式转化为糖酵解为主Fig 1 The energy metabolism converts from oxidative phosphorylation to glycolysis during the reprogramming

2010年Stem Cell 上有研究报道，经过再程序化过程iPSC 的线粒体回复到类似胚胎干细胞的状态，同时发现细胞内ROS 及超氧化物阴离子水平低于其来源的成纤维细胞，其抗氧化基因的表达及抗氧化能力均高于其来源的成纤维细胞，而与人胚胎干细胞相似［14］。在同期另一篇研究也报道了iPS 细胞内线粒体的变化，并发现未分化的iPS 细胞内由ROS 损伤的蛋白质、DNA 及脂质水平与人胚胎干细胞相似，但明显低于其来源的成纤维细胞，线粒体相关的氧化应激途径可能与iPS 细胞抵抗ROS 导致的细胞衰老有关［15］。

ROS 是导致细胞损伤及衰老的重要原因之一，而iPS 与其来源的成纤维细胞抗ROS 损伤能力的差异可能与再程序化过程导致的线粒体结构、数量及功能的变化有密切的联系，不难推论出线粒体对于iPSC再程序化过程中的细胞衰老有着重要的影响。

在正常生理状态及特异发育阶段，线粒体可以被非特异或特异的自体吞噬过程清除，自体吞噬能够清除损伤、无功能及多余的线粒体，从而调整线粒体的数量及质量，以适应新的微环境需要。研究者在复制衰老模型中发现线粒体融合增加、巨大线粒体形成及与线粒体分裂有关的蛋白表达减少，将导致自体吞噬清除的线粒体减少，证实线粒体分裂状态的维持对线粒体自体吞噬是必须的［16］。进一步研究表明，线粒体由复杂蛋白质网络精确调控其融合及分裂状态，从而维持其在细胞内的平衡，线粒体分裂的调节子Fisl 在衰老的细胞中下调，特异的抑制Fisl 的表达将使线粒体伸长，同时出现细胞体积变大、细胞折光度减低等细胞衰老的形态表现，过表达Fisl 将能有效逆转线粒体伸长及细胞的衰老表型［17］。体细胞重编程为iPSC 的过程需要借助外界因素的诱导，外界因素一方面有可能使线粒体分裂增加而上调自体吞噬，导致线粒体数量及大小的显著减少，从而有利于iPSC 再程序化进行，另一方面可能使线粒体融合增加，下调自体吞噬，从而产生巨大线粒体导致细胞衰老而阻碍iPSC 再程序化的进行。最近研究已经发现，一些小分子物质及自体吞噬活化剂能使线粒体分裂增加，上调自体吞噬使线粒体数量的减少，从而提高iPS 细胞产生效率和速度［18］。

尽管目前有关线粒体对iPSC 再程序化过程中细胞衰老的影响不甚清楚，但不难推论，调控线粒体的状态对减少iPSC 再程序化导致的细胞衰老有着重要意义。

iPS 技术已有所突破，然而对重编程的机制的研究仍处于起步阶段，尤其是重编程过程中的关键问题目前知之甚少。细胞的重编程是一个复杂的过程，线粒体与iPSC 再程序化过程中能量代谢的转换及细胞衰老有着密切关系，但具体的机制目前仍不清楚。线粒体对于细胞再程序化究竟有哪些作用，其作用机制是什么，如何通过调节线粒体的生物合成及线粒体状态从而提高iPSC 的重编程效率等许多问题仍有待于去揭示。

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