CDKAL1基因rs4712523多态性与内蒙古地区汉族人群2型糖尿病相关

李晓晶，苏 燕*，闫朝丽，顾 丽，李彩萍，李爱珍

(包头医学院1.生物化学与分子生物学教研室;2.病原生物教研室，内蒙古包头014060;3.内蒙古医科大学第一附属医院内分泌科，内蒙古呼和浩特010050)

2007年全基因组研究发现，细胞周期依赖性蛋白激酶5 调控相关蛋白1 样1 (cyclin-dependent kinase 5 regulatory subunit associated protein 1-like 1，CDKAL1)基因是人类2 型糖尿病(Type 2 diabetes，T2DM)最重要的风险基因之一。人CDKAL1基因定位于6p22.3，全长37 kb，编码含579 个氨基酸残基的蛋白。rs4712523 位于CDKAL1 非编码区5 号内含子上，研究发现，其单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)与T2DM 发病显著相关［1－4］。由于种族遗传背景及生存环境的不同，在不同种族中印证已报道的疾病相关基因或位点对人类复杂性疾病发病机制的研究具有重要意义。本实验采用等位基因特异性聚合酶链式反应(AS-PCR)研究内蒙古地区汉族人群的CDKAL1 基因rs4712523 多态性与T2DM 相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象

T2DM 组和正常对照组抗凝血取自2008年1月至2009年12月到内蒙古医学院第一附属医院内分泌科住院和体检的内蒙古地区无血缘关系的汉族人群。T2DM 组192 例(男98 例，女94 例，平均年龄52.5 ±9.7 岁，ΒMI 25.31 ±3.27)，对照组190 例(男101 例，女89 例，平均年龄50.5 ±7.5 岁，ΒMI 23.82 ±3.97)。T2DM 根据1999年WHO 制定的糖尿病诊断标准确诊，血样50 μL/管分装后，－40 ℃保存备用。以上研究方案符合人体试验伦理学标准，并得到伦理委员会的批准，受试者在受试前知情同意并签署知情同意书。

1.2 试剂

DNA 提取裂解液由包头医学院基因诊断研究所秦文斌教授惠赠;rs4712523 A/G PCR 引物(sense1:5'-CTTCTCCTTCTGTTGCACCCA-3'，sense2:5'-CTT CTCCTTCTGTTGCACCCG-3'，anti-sense:5'-CTGGAA GGAAAACAAAAGCA-3')由北京奥科生物科技有限公司合成;2 ×Taq Mix(北京博迈德科技发展有限公司);琼脂糖、DL2000 DNA Marker、T 载体、DNA 凝胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒(大连宝生物工程有限公司)。

1.3 研究方法

DNA 提取按照本室常规方法进行［5］。利用等位基因特异性PCR(allele-specific polymerase chain reaction，AS-PCR)进行多态性分析，引物由北京奥科生物科技有限公司合成。PCR 反应的总体积10 μL，其中DNA 模板1.5 μL、2 × Taq Mix 5 μL、10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL、灭菌水2.5 μL。rs4712523 A/G 位点的PCR 反应条件为:94 ℃预变性2 min，94 ℃变性60s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35 个循环;72 ℃终延伸5 min。扩增产物直接进行1%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察记录结果并判读基因型。每种基因型产物均通过切胶回收连接T 载体后，送北京博迈德科技发展有限公司进行测序。此外，抽取10%的样本重复进行基因分型。

1.4 统计学分析

应用SPSS13.0 统计学软件。计量资料以均数±标准差(±s)表示;率的比较采用x2检验。通过x2检验判断多态性位点的基因型频率分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡，计算组间各基因型频率及等位基因频率;Logistic 回归分析计算OR 值及95% CI。

2 结果

2.1 临床参数的比较及Hardy-Weinberg 平衡检测

T2DM 组与对照组的年龄和性别之间无统计学意义，T2DM 组的BMI 显著高于对照组(P＜0.05)(表1)。对T2DM 组和对照组3 种基因型的实际频数和理论频数进行x2检验，基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg 平衡，说明两组样本都具有群体代表性，能够反映内蒙古地区汉族人群的总体情况。

表1 T2DM 组和对照组的一般临床指标Table 1 General clinical indices of T2DM group and control group (±s)

表1 T2DM 组和对照组的一般临床指标Table 1 General clinical indices of T2DM group and control group (±s)

＊P＜0.05 compared with control group．

groupsex(male/female) age (year)BMI(kg/m2)control101/8950.5 ±7.523.82 ±3.97 T2DM98/9452.5 ±9.725.31 ±3.46*

2.2 CDKAL1 基因rs4712523 SNP 基因型和等位基因频率分布

CDKAL1 基因rs4712523 位点PCR 扩增产物长度为169 bp，与测序结果吻合，分别可以得到AA、AG 和GG 3 种基因型。T2DM 组与正常对照组rs4712523 位点均以AG 基因型为主，3 种基因型在两组间的分布有显著性差异(x2= 25.666，P＜0.001)，其中T2DM 组的GG 和AG 基因型频率(6.3%，82.3%)均高于正常对照组(3.2%，64.2%)。此外，T2DM 组G 等位基因频率增高，A等位基因频率降低，A 和G 等位基因频率在两组间分布有显著性差异(x2=11.592，P＜0.05)，G 等位基因携带者患T2DM 的风险是A 等位基因的1.654倍(OR=1.654，95% CI=1.237－2.212)(表2)。

表2 T2DM 组与对照组组CDKAL1 基因rs4712523位点基因型分布和等位基因频率Table 2 The genotype distribution and allele frequency of rs4712523 in CDKAL1 gene of T2DM and control group

3 讨论

CDK5 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在胰腺组织中通过形成CDK5/P35 复合物被激活，从而抑制胰岛素的分泌作用［6］，特别是在高血糖条件下CDK5 的过度活化使胰岛素释放率下降，降低胰岛素的产生和减少胰岛素基因表达［7］。研究发现CDKAL1在人类胰腺、骨骼肌细胞及脑组织中高度表达，其蛋白能够特异地抑制CDK5 的活化［6－8］。也有报道认为CDKAL1 可以通过促进ATP 的生成，而控制β 细胞内第一阶段胰岛素的释放［9］。因此，CDKAL1 基因突变可能导致对CDK5 抑制作用的丧失，进而增加罹患T2DM 的风险。本研究对内蒙古地区汉族人群382 例血液样本进行检测，入选本实验的两组人群在性别和年龄上均互相匹配，用AS-PCR对rs4712523 A/G 基因进行基因分型，操作简便、经济、重复性好。结果表明，CDKAL1 基因rs4712523 位点的3 种基因型在T2DM 组与对照组中的分布差异有统计学意义，G 等位基因携带者患T2DM 的风险是A 等位基因的1.654 倍。以上结果说明，CDKAL1 基因rs4712523 多态性与内蒙古地区汉族人T2DM 的发病具有显著相关性，G 等位基因是T2DM 的风险等位基因。本研究结果与目前相关文献报道的欧洲、亚洲人群［10－11］结果基本一致。但CDKAL1 基因如何引起胰岛素分泌改变的机制尚不清楚，有待通过进一步研究来阐明。

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