空间学习记忆训练对大鼠海马Caveolin-1蛋白表达的影响

嵇志红，邹 伟

（1.大连大学 医学院，辽宁 大连 116622；2.辽宁师范大学 生命科学院，辽宁 大连 116029）

空间学习记忆训练对大鼠海马Caveolin-1蛋白表达的影响

嵇志红1，邹 伟2

（1.大连大学 医学院，辽宁 大连 116622；2.辽宁师范大学 生命科学院，辽宁 大连 116029）

探讨空间学习记忆训练后大鼠海马Caveolin-1（Cav-1）蛋白表达的变化。采用Morris水迷宫实验检测大鼠的空间学习记忆能力，Western Blot方法检测大鼠海马Cav-1蛋白表达的变化。结果显示：水迷宫实验中，与青年训练组比，老年训练组大鼠的逃避潜伏期明显延长（P＜0.05，P＜0.01），穿台次数明显减少(P＜0.05)，在原平台象限的停留时间明显缩短(P＜0.05)。Western Blot检测表明，与青年和老年对照组比，青年和老年水迷宫训练组大鼠海马Cav-1蛋白表达显著增加（P＜0.05）；与青年对照组比，老年对照组大鼠海马Cav-1蛋白表达显著升高（P＜0.01）；与青年训练组比，老年训练组大鼠海马Cav-1蛋白表达显著升高（P＜0.01）。结果提示Cav-1蛋白可能参与了空间学习记忆过程。

空间学习记忆；Caveolin-1蛋白；海马

Caveolae是细胞质膜上特殊的凹陷结构（胞膜窖），含有丰富的胆固醇和鞘磷脂。Caveolin-1（Cav-1）是 Caveolae的主要结构组分和标志蛋白，在胆固醇运输、膜组装、信号转导和肿瘤发生等过程中发挥着重要的作用[1-2]。研究表明，在胚胎发育过程中脑内几乎没有Cav-1蛋白的表达，但生后Cav-1表达逐渐增加，成年后表达下调，表明Cav-1的表达与生后脑发育密切相关[3]。近年研究还发现，Cav-1与脑功能的生理和病理变化有关，它影响神经发育、突触可塑性、神经退行性疾病的发生等过程[4-5]。有实验表明，Y-迷宫分辨学习训练后大鼠皮层内 Cav-1表达显著升高，提示Cav-1可能在分辨学习记忆过程中起作用[6]。但目前为止，有关Cav-1是否参与空间学习记忆过程及其作用机制尚未见报道。本实验采用 Morris水迷宫对青年和老年大鼠进行空间学习记忆训练，通过Western blot检测空间学习记忆训练后Cav-1表达的变化，为探讨Cav-1在空间学习记忆过程中的作用提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

3月龄（青年）与 18月龄（老年）健康雄性Spague-Dawley大鼠各16只，购于大连医科大学SPF实验动物中心。青年雄性大鼠随机分为2组：青年对照组（YC），青年训练组（YT）。老年大鼠也随机分为2组：老年对照组（OC），老年训练组（OT）。各组大鼠严格按饲养条件分笼饲养，标准鼠食，自由饮水，自然昼夜。

1.2 试剂与仪器

抗兔 caveolin-1（N-20）多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；HRP-抗兔IgG与抗鼠actin单克隆抗体购自武汉博士德生物公司；ECLTM试剂购于美国Amersham Biosciences公司；其它试剂为国产分析纯。DMS-2型Morris水迷宫（中国医学科学院药物研究所）；全自动酶标仪（SUNRISE TECAN公司）；MV-Ⅱ型双垂直板式电泳槽和PS-9型半干式转移电泳仪（大连竟迈生物科技有限公司）；SuperT21离心机（美国索福公司）。

1.3 Morris水迷宫空间学习记忆训练

共历时6 d。前5 d进行定位航行试验，隐蔽平台置于东南象限中央水面下1 cm，每只大鼠每天训练4次，每次120 s，两次间隔20 min，仪器自动记录从入水到找到隐蔽平台并立于其上所需时间（逃避潜伏期），数据取4次均值。第6 d进行空间探索试验，撤去平台，然后在西北象限（原平台对侧象限）入水点将大鼠面向池壁放入水中，测定120 s内在4个象限的游泳时间，其中东南象限（原平台象限）的时间为记忆保持时间，同时记录大鼠2 min内穿过原平台象限的次数。

1.4 Western blot分析

实验结束后断头处死各组大鼠，冰上分离海马，称重后置于脑蛋白裂解液中，冰上匀浆裂解1～2 h，4℃冷冻离心机 10 000 r/min离心 15 min，取上清，Bradford法进行蛋白定量。制备 12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶，取100 μg总蛋白上样，电泳2 h；半干转移法转膜30 min(PVDF膜)；5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h；Cav-1抗体(1：1000) 4℃孵育过夜，PBST漂洗3次，每次10 min；加入HRP-抗兔IgG(1：6000)室温摇床中孵育1 h，PBST洗3次，每次5～10 min；ECL显色，x光片曝光。凝胶成像系统对胶片进行薄层密度扫描，记录相应条带的透射光积分光密度(IOD)值反映蛋白含量，β-actin 条带作为内参。

1.5 数据统计分析

数据以x±s表示，应用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，组间差异用t检验，P〈0.05表示有显著性差异。

2 结果

2.1 青年与老年大鼠空间学习记忆能力的变化

水迷宫定位航行实验中，随着训练天数增加，青年组与老年组大鼠的逃避潜伏期均呈缩短趋势，但青年组的逃避潜伏期在第4、第5天已明显缩短，而老年组缩短的不明显。与青年组大鼠相比较，除第二天外，其它天数老年组大鼠的逃避潜伏期均明显延长（P＜0.05，P＜0.01），尤以第4、第5天明显（见表1）。空间探索试验中，与青年组比，老年组大鼠的穿台次数及在原平台象限的停留时间均明显少于青年组(P＜0.05)，而在对侧平台象限的停留时间无明显差异。

表1 定位航行实验中大鼠的逃避潜伏期（s）（n=8）

表2 空间探索试验中大鼠的穿台次数和象限停留时间（n=8）

2.2 空间学习记忆对海马Cav-1蛋白表达的影响

为研究Cav-1蛋白在空间学习记忆中的作用，我们选择青年大鼠（YT）和老年大鼠（OT）进行Morris水迷宫空间分辨学习训练，以不训练（只游泳不找平台）的青年大鼠（YC）和老年大鼠（OC）作为对照。水迷宫训练结束后，Western blot检测了海马 Cav-1蛋白的表达。结果表明，青年和老年水迷宫训练组大鼠海马内 Cav-1蛋白表达分别显著高于青年和老年对照组海马（P＜0.05），而且老年对照组大鼠海马Cav-1蛋白表达显著高于青年对照组（P＜0.01），老年训练组大鼠海马 Cav-1蛋白表达显著高于青年训练组（P＜0.01）。结果提示Cav-1蛋白可能参与了空间学习记忆过程（见图1）。

图1 空间学习记忆后海马Caveolin-1蛋白表达

3 讨论

学习和记忆是构成人脑智能的要素。中枢神经系统内突触联系的复杂性和可塑性是学习记忆的神经生理学基础，但其详细机制目前尚不清楚。随着增龄，大脑在神经生理、生化及组织形态学等方面发生一系列退行性改变，即脑老化，临床最突出的特征之一就是学习记忆能力减退。越来越多的证据表明脑老化与突触可塑性的“丢失”有关[7-8]。突触传递过程及突触可塑性形成涉及许多蛋白参与。目前已知海马内与学习记忆信号转导相关的蛋白约有百余种，这些信号分子通过启动细胞内不同的信号通路，影响海马突触可塑性，在学习记忆及脑功能的调节中发挥重要的作用。Cav-1是细胞质膜小窝的标志蛋白，近年来人们对Cav-1的研究主要集中在癌症、心血管疾病、糖尿病、肌营养不良、炎症反应等方面，但最近发现中枢神经系统也有 Cav-1蛋白的表达，而且脑发育不同阶段Cav-1蛋白的表达水平不同。也有研究表明在海马神经元轴突和树突突起中有 Cav-1的表达，过量表达Cav-1的PC12细胞在损伤后伸出突起的数目增加[9]。这些研究表明，神经细胞内Cav-1的表达可能与突触可塑性活动有关。

以往研究发现，经过 Y-迷宫学习训练的青年大鼠海马、前额叶皮层内Cav-l蛋白的表达与未训练大鼠比较，均有显著增加[10]。由于海马与空间记忆的形成密切相关，因此本实验选用可以反应空间学习记忆能力变化的 Morris水迷宫，作为行为训练的实验平台。结果表明，与青年大鼠比，老年大鼠水迷宫实验的逃避潜伏期明显延长，穿台次数明显减少，在原平台象限的停留时间明显缩短，这些说明老年大鼠的空间学习记忆能力较差。进一步Western blot检测表明，无论青年还是老年大鼠，Morris水迷宫训练后海马内Cav-1的表达都显著升高，这与我们以往的实验结果一致，说明Cav-1参与了空间学习记忆过程，它的表达升高可能通过某种机制加强了突触可塑性。另外本实验还发现，老年大鼠海马内Cav-1表达要明显高于青年大鼠，这似乎与其加强空间学习记忆能力相违背，但也可以这样认为，由于老年大鼠的空间学习记忆能力减退，Cav-1表达增高可以作为一种代偿机制。

综上所述，Cav-1蛋白与空间学习记忆密切相关。至于 Cav-1参与空间学习记忆的机制及其信号转导途径，有待于后续实验进一步研究。

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Effects of Spatial Learning-memory Training on Expression of Caveolin-1 in Rat Hippocampus

JI Zhi-hong1, ZOU Wei2
（1. Medical College of Dalian University, Dalian 116622, China; 2. College of Life Science, Liaoning Normal University, Dalian 116081, China）

To investigate the effects of spatial learning-memory training on expression of Caveolin-1 in rat hippocampus. Spatial learning-memory ability was tested by Morris water maze test, and the expression of Caveolin-1 in hippocampus was examined by Western blot. Results showed that the escape latency in aged training group was significantly longer (P＜0.05, P＜0.01), The number of rats through the platform was significantly decreased (P＜0.05), and the time spent in the original quadrant that previously contained the platform was significantly shorter (P＜0.05), compared with the youth training group. Western blot showed the expression of Caveolin-1 in hippocampus of youth training and aged training group was significantly enhanced, compared with the youth and aged control group respectively (P＜0.05), and significantly enhanced in hippocampus of aged control group than youth control group (P＜0.01), and significantly enhanced in hippocampus of aged training group than youth training group (P＜0.01). The results suggest that Caveolin-1 might be involved in the process of spatial learning and memory.

spatial learning-memory; Caveolin-1 protein; hippocampus

R741

：A

：1008-2395(2013)06-0035-03

2013-10-15

国家自然科学基金资助项目(30970353)。

嵇志红（1964-），女，副教授，研究方向：神经生物学。