煎煮时间对关木通中马兜铃酸A煎出量的影响

王世信　杨美娜

（河北省沧州中西医结合医院，沧州061000）

煎煮时间对关木通中马兜铃酸A煎出量的影响

王世信杨美娜

（河北省沧州中西医结合医院，沧州061000）

目的 研究不同煎煮时间对关木通的水煎液中马兜铃酸A的含量的影响。方法 定性鉴别：采用薄层层析法对关木通水煎液中的马兜铃酸A进行定性鉴别：以甲苯：乙酸乙酯：甲酸：水 （20∶10∶1∶1）作为展开剂，以马兜铃酸A标准品作为对照进行薄层分析。定量分析：采用高效液相色谱法对马兜铃酸A进行含量测定。色谱条件：C18柱；流动相：甲醇：水：冰醋酸 （72∶27∶1）；检测波长：315nm；流速：1.0ml／min；柱温：25℃。结果 结果显示：①在可见光下，供试品溶液中在与标准品溶液相应的位置上有淡黄色斑点；在365nm紫外光下，斑点为暗斑。②在0.522～5.22μg范围内，马兜铃酸A的峰面积与浓度呈良好的线性关系。结论 不同煎煮时间下的关木通水煎液都有马兜铃酸A溶出，但是一定时间内，煎煮时间越长，马兜铃酸A煎出越多。煎煮时间不变，延长浓缩时间会使马兜铃酸A含量减少。

关木通；马兜铃酸A；煎煮时间；高效液相色谱法；薄层色谱法

关木通（Caulis Aristolochiae Manshuriensis，CAM）为马兜铃植物东北马兜铃Aristolochia manshruiensis Kom的干燥藤茎。关木通苦寒有毒，有清心火、利小便、通经下乳之功效，用于口舌生疮、心烦尿赤、水肿、热淋涩痛、白带、经闭乳少、湿热通痹等。现代研究表明其药理作用有利尿、抗突变、抗肿瘤及降血压的作用［1］。关木通的主要化学成分为马兜铃酸A、B、D，马兜铃苷，马兜铃D甲醚，木兰花碱等。其中马兜铃酸为主要毒性成分，且含量最大，易导致慢性肾功能衰竭［2］。2003年6月国家食品药品监督管理局发出通知取消其药用标准，这意味着关木通从此不能作为一种合法中药使用。为此，业内人士一直在寻求降低马兜铃酸浸提率的方法，以求让关木通摆脱有严重副作用的困扰，重新发挥它优越的作用。本实验从煎煮时间及浓缩时间的角度分别利用薄层色谱法和高效液相法研究了关木通中马兜铃酸A含量的变化。

1　材料与方法

1.1仪器与药品

1.1.1仪器高效液相色谱仪（安捷伦1200），色谱柱XDB C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；安捷伦1200色谱工作站（浙江大学）；TG328B型分析天平；不锈钢锅，燃气灶，SHZ-D循环水式真空泵，DRT电热套（220V），KQ-500DV数控超声波清洗仪，圆底烧瓶，冷凝管，分液漏斗，10ml容量瓶，冰箱，展缸，紫外灯，玻璃板，毛细玻璃管等。

1.1.2药品甲醇为色谱纯，95%乙醇、盐酸、三氯甲烷、甲苯、乙酸乙酯、甲酸 （均为分析纯，购于南京化学制剂厂），硅胶G（上海化学制剂公司），关木通药材（购于乐仁堂药店），马兜铃酸A标准品 （购于中国药品生物制品检定所，批号：110713-200708）。

1.2薄层色谱法检测马兜铃酸A

1.2.1薄层板的制备称取10g硅胶G于研钵中，到入约30ml CMC-Na溶液，搅拌使之均匀且无气泡。均匀铺于干净的玻璃板上，晾干，备用。

1.2.2供试品溶液制备分别精称10g关木通药材置两个不锈钢锅中，并标记作为两个实验组。分别加入300ml水浸泡2小时后，分别煎煮两次（一煎分别为45分和30分，二煎分别为30分和20分），合并两次煎液，浓缩至100ml。冷却后分别加入1.5倍95%乙醇，静置过夜。抽滤，弃去沉淀。回收乙醇，冷却，用盐酸调PH至1，用三氯甲烷萃取至无色（10～15ml／次）。回收三氯甲烷至少量时，移至蒸发皿中挥干，用甲醇溶解残渣，定容至10ml，并标记。于4℃冷藏，备用，待测。

1.2.3标准品溶液制备取马兜铃酸A标准品0.2610g，用甲醇定容至1ml，作为标准品溶液。

1.2.4阴性对照溶液的制备向锅中加入300ml水，根据供试品溶液的制备方法制备。

1.2.5薄层层析条件分别吸取上述两种供试品溶液、阴性对照溶液和标准品溶液各4μl，点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸∶水 （20∶10∶1∶1）展开。取出，晾干，于365nm紫外灯下观察。

2　结果

在可见光下，供试品溶液中在与标准品溶液相应的位置上有淡黄色斑点；在365nm紫外光下，斑点为暗斑。

2.1高效液相色谱法测定关木通中马兜铃酸A的含量

2.1.1色谱条件色谱柱：XDB C18柱（250mm× 4.6mm，5μm）；流动相∶甲醇∶水∶冰醋酸（72∶27∶1）；检测波长：315nm；柱温：25℃；流速：1.0ml／min；进样量：5μl；理论塔板数以马兜铃酸A峰计应不低于2900。

2.1.2对照品溶液的制备取马兜铃酸A标准品，精密称定5.2219mg，置于10ml容量瓶中，用适量甲醇稀释，将容量瓶置于超声波清洗器中超声使充分溶解，用甲醇定容至刻度，摇匀即得（0.5220mg／ml）。

2.1.3供试品溶液的制备同1.2.2。

2.1.4阴性对照溶液的制备同1.2.3。

2.2系统适应性实验精密吸取2.1项下已制备好的对照品、供试品和阴性空白样品溶液，照2.1.1项下色谱条件，各进样10μL，理论塔板数按马兜铃酸A峰计算不低于2900，色谱图见图1-4。

图1　高效液相色谱图 （标准品）

图2　高效液相色谱图（样品1）

图3　3高效液相色谱图（样品2）

图4　高效液相色谱图 （阴性对照）

2.3线性关系考察分别精密吸取对照品溶液（浓度为0.522mg／ml）1ml，2ml，4ml，6 ml，8 ml，10ml至10ml容量瓶中，用甲醇定容。按上述色谱条件进样检测，测定其峰面积值，并以马兜铃酸A峰面积Y为纵坐标，对样品中马兜铃酸A进样量X进行回归，求得标准曲线方程y=2121.5x+2.995；r=0.9999。结果表明在0.522～5.22μg范围内，马兜铃酸A的峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.4精密度实验精密吸取稀释至0.261mg／ml的对照品溶液，连续进样6次，在上述条件下进行HPLC分析。RSD=0.07%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.5重现性实验精密称取关木通药材，按1.2.2项下样品1的方法制备六份样品供试品溶液，分别进行测定。测定其浓度的平均值为0.356，RSD为0.81%（n=6），表明该方法重现性良好。

2.6稳定性实验精密称取关木通药材适量，按1.2.2项下样品1操作制备供试品溶液，分别于第0，1，2，4，8，12，24小时在上述色谱条件下进行HPLC分析。结果RSD=0.28%（n=7），表明供试品稳定。

2.7加样回收试验精密称取关木通药材6份，精密加入一定量的马兜铃酸A标准品溶液，按1.2.2项下样品2操作制成供试品溶液，在上述色谱条件下进行HPLC分析，结果平均回收率为99.58，RSD为1.17%（n=6），表明该方法具有良好的回收率。

2.8样品测定 精密称取关木通药材，按1.2.2项下操作制成供试品溶液，在上述色谱条件下进行HPLC分析，结果样品1（煎煮时间长）的马兜铃酸A含量为0.354mg／ml，样品2（煎煮时间短）的马兜铃酸A含量为0.160mg／ml。

3　讨论

马兜铃酸系一类具有明确肾毒性的物质，长期或过量服用易导致癌症或肾衰竭等。近年来，国内外已经有不少因为服用马兜铃酸过量而导致肾衰竭的病例。然而马兜铃属植物具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、镇痛、抗生育以及对心血管的药理作用在临床上是毋容置疑的。但是含马兜铃酸的药材因为其有肾毒性，被禁止使用，其药用作用也随之被否定，不免有“因噎废食”之嫌。因此我们既不能一味排斥马兜铃酸的药用价值，又不能无视毒性的存在。为了寻求控制马兜铃酸含量的方法，严格控制其含量范围，以保证临床用药的安全，让马兜铃属植物重新为医疗事业服务，本实验研究了不同煎煮时间对关木通中马兜铃酸A煎出量的影响。结果表明在一定时间内，煎煮时间越长，马兜铃酸煎出量越多，煎煮时间越短，马兜铃酸煎出量越少。原因可能是煎煮时间越长，对药材中马兜铃酸提取越充分，故而含量大。

另外，本实验还研究了浓缩时间对马兜铃酸A含量的影响，当煎煮时间不变而单独延长浓缩时间时，马兜铃酸A的含量有显著降低。原因可能在于浓缩药液中马兜铃酸A不再浸出，而同时马兜铃酸A在加热条件下不稳定［3］，高温能够有效的破坏马兜铃酸A，故而含量降低。因此，有效控制马兜铃酸A的释放，可以从煎煮时间及浓缩时间两个方面上进行调整。

［1］王瑛，潘竞先，高建军，等.中药关木通中的抗肿瘤成分研究［J］.北京医科大学学报，2000，32（1）：18.

［2］张金莲，张的凤，喻松仁.关木通配伍减毒研究进展［J］.江西中医学院学报，2007，18（6）：74-6.

［3］王勇，夏博，邓晓春.马兜铃酸Ⅰ在煎煮过程中的缩合反应研究［J］.中草药. 2010，41（8）：1288-1292.

10.3969／j.issn.1672-2779.2013.04.112

：1672-2779（2013）-04-0161-03

张文娟

2013-01-25）