实时荧光PCR法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的研究

方 莉，龙思琪，许 媛，唐 中，赵维皎，黄义山，廖 涛△

（1.川北医学院附属医院检验科，四川南充637000；2.川北医学院医学检验系，四川南充637000）

由于抗菌药物的广泛使用，近年来耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的检出率不断增高，MRSA不仅只对甲氧西林耐药，对β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类等多种抗菌药物均耐药，表现出多重耐药性［1-2］。快速、准确的检出 MRSA，对临床选用合适的抗菌药物具有重要的意义［3］，也有利于控制MRSA的流行传播。本文旨在使用实时荧光PCR法检测临床标本中的mecA基因和nuc基因，为临床检测MRSA提供了一种快速、有效的方法，有效减少MRSA的医院感染。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 收集2012年1～6月川北医学院附属医院新生儿科、皮肤科、烧伤科、脑外科、骨科、ICU等科室的45例患者的痰液和脓液标本，保存在-40℃冰箱中备用。其中40份临床标本被检验科微生物室分离鉴定为MRSA，2份标本被鉴定为甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（MSSA），3份标本被鉴定为耐甲氧西林的表皮葡萄球菌。

1.1.2 菌株来源 40株检验科微生物室分离鉴定为 MRSA的菌株，来源于上述临床标本的分离培养，并经血浆凝固酶实验及vitek2-compact细菌快速培养和药敏检测系统鉴定为MRSA，菌株保存于-40℃冰箱中。

1.1.3 主要试剂及仪器 实时荧光定量PCR仪（ROCHE Lightcycler480Ⅱ）、vitek2-compact细菌快速培养和药敏检测系统（法国生物梅里埃）、MRSA基因检测试剂盒（上海之江生物）、MRSA鉴定培养基（法国生物梅里埃）。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养鉴定药敏实验 将40份痰液和脓液标本按微生物室标准化操作规程进行处理，分离培养后对于形似葡萄球菌的菌落作革兰染色，触酶实验，血浆凝固酶实验，然后利用GP鉴定卡及AST-GP药敏卡作细菌的鉴定及药敏实验。

1.2.2 MRSA培养基鉴定实验 将40份痰液和脓液标本接种于MRSA鉴定培养基上，于37℃有氧条件下孵育18～24h后观察结果。18h后，若培养基上呈典型的绿色菌落则为阳性，但是如果培养基上无细菌生长或无任何颜色必须再孵育24h方可确定为阴性。

1.2.3 实时荧光PCR法检测mecA基因及nuc基因 按上海之江生物科技提供的MRSA耐药基因检测试剂盒说明书，分别对40份含有MRSA菌的临床标本和对应的MRSA分离菌株进行mecA基因和nuc基因的检测。2份含有MSSA的临床标本作为nuc基因的阳性对照和mecA基因的阴性对照；3份含有耐甲氧西林的表皮葡萄球菌的临床标本作为nuc基因的阴性对照和mecA基因的阳性对照。

1.2.4 临床标本预处理 痰液：标本中加入等体积的4%NaOH溶液，放于37℃条件下处理30min，使其充分液化。脓液：标本若采用一次性棉拭子送检，加入1mL无菌生理盐水，振荡混匀，形成混悬液，于13 000r／min离心10min后保留沉淀备用。标本若为黏稠状，应加入等体积的4%NaOH溶液，放于37℃条件下处理30min，使其充分液化。将液化完全的标本4 000r／min离心10min弃上清液后加入1mL无菌生理盐水，于13 000r／min离心10min。重复以上操作3次后保留沉淀备用。

1.2.5 菌株的预处理 将菌株置入预先装有生理盐水的离心管中形成0.5麦氏单位的混悬液后，取1mL菌悬液13 000r／min离心10min后保留沉淀备用。

1.2.6 核酸提取 向1.2.4和1.2.5的沉淀中加入 DNA 提取液50μL，充分混匀，放入100℃干浴10min，13 000r／min离心5min，保留上清液作为模板DNA。

1.2.7 反应体系 总反应体系20μL，包含17.6μL PCR反应液、0.4μL Taq酶、2μL模板DNA。

1.2.8 PCR反应条件 37℃2min，94℃2min，94℃15s，60℃60s，40个循环；单点检测荧光在60℃。荧光通道检测选择FAM通道和HEX通道。

1.2.9 结果判断 mecA基因、nuc基因检测同时为阳性，判断为MRSA；mecA基因阴性、nuc基因阳性，判断为 MSSA；mecA基因阳性、nuc基因阴性，判断为耐甲氧西林菌株（非金黄色葡萄球菌）。

1.3 统计学处理 采用SPSS软件进行统计学分析，各方法间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 实时荧光PCR法检测临床标本的结果 实时荧光PCR法检测vitek2-compact细菌鉴定的40份含有MRSA菌的临床送检标本，结果见表1。3份耐甲氧西林的表皮葡萄球菌的临床标本的检测结果均为mecA基因阳性、nuc基因阴性。2份MSSA临床标本的检测结果为mecA基因阴性、nuc基因阳性，检测结果符合质控要求。

表1 含有MRSA的临床标本的mecA基因、nuc基因检测结果［n（%）］

2.2 实时荧光PCR法检测临床分离的MRSA菌株 PCR检测临床分离的MRSA菌株，40株菌株均检测出mecA基因、nuc基因阳性。PCR检测纯培养的菌株，MRSA检出率为100%。

2.3 实时荧光PCR法与vitek2-compact细菌鉴定药敏法、MRSA鉴定培养基实验结果比较 实时荧光PCR法检测临床标本，与vitek2-compact细菌培养药敏检测系统鉴定结果的符合率为90%；检测MRSA菌株，与vitek2-compact细菌培养药敏检测系统鉴定结果的符合率为100%。MRSA鉴定培养基鉴定出38株MRSA阳性，2株MRSA阴性，与vitek2-compact细菌培养药敏检测系统鉴定比较，MRSA鉴定培养基的假阴性率为5% 。3种方法经χ2检验无显著性差异（χ2＝7.62，P＞0.05）。见表2。

表2 3种方法检测结果［n（%）］

3 讨 论

MRSA是导致医院感染和社区感染的重要病原菌之一。目前临床分离的MRSA呈现不断上升的趋势。2008年全国细菌耐药性监测网对所有三级甲等医院的监测结果显示，MRSA占金黄色葡萄球菌的60%以上［4］，MRSA的危害性在于对多种药物的多重耐药，耐药率较高，MRSA的多重耐药是因为获得了编码青霉素结合蛋白2a（PBP2a）的mecA基因，PBP2a与β-内酰胺类抗菌药物结合力较低，该类抗菌药物不能抑制细菌细胞壁的合成，从而引起耐药［5］。mecA基因目前已作为耐甲氧西林葡萄球菌的分子学标志［6］。有研究认为［7］，根据金黄色葡萄球菌的nuc基因设计特异引物，可以通过PCR快速鉴别金黄色葡萄球菌，nuc基因是金黄色葡萄球菌特有的基因，具有较高的种族特异度。mecA基因和nuc基因联合检测MRSA具有较高的特异度和准确度。对于高度耐药和多重耐药的MRSA，早期检测不仅是控制其感染的关键，也是临床上决定是否用抗MRSA最后一线抗菌药物如糖肽类和噁唑烷酮类抗菌药物的关键［8］。

本实验采用实时荧光PCR法检测2份分离出MSSA的临床标本，结果显示：nuc基因阳性、mecA基因阴性；3份分离出耐甲氧西林的表皮葡萄球菌的临床标本，检测结果显示：nuc基因阴性、mecA基因阳性。结果表明：金黄色葡萄球菌nuc基因阳性而表皮葡萄球菌nuc基因阴性，只有耐甲氧西林的表皮葡萄球菌mecA基因阳性。本研究结果与nuc基因是金黄色葡萄球菌的特有基因、mecA基因是耐甲氧西林葡萄球菌的分子学标志的结论一致。

与其他检测MRSA研究不同的是，本实验采用临床标本直接进行实时荧光PCR法检测。实时荧光PCR法检测mecA基因与nuc基因同为阴性的4份临床标本，经提取分离MRSA菌的DNA后，检测其mecA基因、nuc基因均为阳性。说明实时荧光PCR法检测MRSA纯培养细菌的敏感性高，但PCR检测临床标本中MRSA的敏感性还需要改进。分析其原因可能为：（1）由于痰标本、各类拭子中存在着影响细菌裂解释放DNA的因素，简单的煮沸法可导致假阴性结果的出现［9］；（2）使用4%NaOH液化标本后，未充分洗涤干净，pH过高可抑制PCR反应，造成假阴性结果；（3）在标本洗涤、冻存、提取DNA模板过程中，原始标本中的MRSA菌含量极低，可能不能有效提取到MRSA的DNA模板，造成PCR结果的假阴性。实时荧光PCR法检测临床标本与细菌培养鉴定的符合率为90%，说明直接用标本提取DNA模板的技术有待提高［9］。实时荧光PCR法检测临床标本分离的MRSA菌株与vitek2-compact细菌培养鉴定药敏检测系统鉴定结果的符合率100%，去除了用标本提取DNA模板的影响因素，用MRSA菌株进行PCR检测，实验的准确度明显的提高。

实时荧光PCR法检测临床标本中的MRSA，与vitek2-compact细菌鉴定药敏法、MRSA鉴定培养基实验结果比较，差异无统计学意义（χ2＝7.62，P＞0.05）。实时荧光PCR法的灵敏度高、特异度强，检测方便简单、快捷，可以在标本接收的2～3h内出结果，免去其他两种方法的培养时间，可以满足医院感染防控24h内检测患者入院时是否携带MRSA的要求。本研究提示条件成熟的实验室可以开展实时荧光PCR法检测MRSA，能更加快速准确地为临床提供实验室数据，有效控制MRSA的医院感染传播。

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