成年维生素D缺乏大鼠模型的建立及评价

李清华，张丰香，邵丽军，王 飞，翟 强，连 波，杨潍潍，王国辉

（潍坊医学院：1.公共卫生学院预防实验室；2.公共卫生学院营养食品与儿童少年卫生学教研室；3.药学与生物科学学院生物技术实验室；4.药学与生物科学学院细胞生物学教研室，山东潍坊261053）

维生素D是人体必需的一种维生素。在人体内，维生素D最重要的作用是调节肝、肾以及小肠中钙、磷吸收与骨合成和代谢［1-2］。近年的研究表明，维生素D在免疫、细胞增殖、分化和激素分泌中发挥重要功能，对免疫调节等正常生理过程的维持起到重要的调控作用，并可保护人群免受多种疾病的困扰，相反维生素D缺乏或不足会引起或影响很多疾病的发生和发展，如糖尿病、心血管疾病、肿瘤等［3-6］。美国41.6%的健康人群处于维生素D缺乏或不足的状态［7］，欧洲人群中维生素D缺乏或不足的情况还要严重；由于饮食习惯的差异，我国人群中维生素D缺乏或不足的情况更为严重［8］。为更好地研究维生素D缺乏与其导致的一系列疾病间的关系，深入探讨维生素D在体内的生理作用，有必要建立维生素D缺乏动物模型。大鼠作为一种常见的实验动物，在营养代谢、血压调节等方面具有独特的研究价值，且在营养代谢等生理方面与人比较接近，因此，本文选取SD大鼠作为建模动物，以探讨维生素D缺乏与高血压发生的相关性，为进一步探讨维生素D缺乏与高血压的相关机制提供基础。

1 材料与方法

1.1 动物与饲料 实验所用大鼠与正常对照饲料均购自北京维通利华公司。维生素D对照饲料与维生素D缺乏饲料均购自江苏特洛菲公司。血清维生素D浓度检测采用IDS vitamin D酶免疫试验（EIA）试剂盒，购自北京荣志海达公司（货号：IDS 57F1）。

1.2 动物模型的建立 将所购得的大鼠分成正常对照组、维生素D对照组、维生素D缺乏组，分别喂以正常对照饲料、维生素D对照饲料、维生素D缺乏饲料。饮水采用清洁饮用水，光照采用无紫外光的白炽灯，维持光暗周期12h：12h，饲养环境为清洁级。

1.3 方法 饲养6周后通过眼底取血的方式采集外周血，使用EIA方法测定血清维生素D含量，之后每隔两周测定1次。

1.4 动物模型评价 记录测量不同处理大鼠的取食情况和生长情况，包括饲料每日消耗、体质量等。

1.5 统计学处理 所有实验数据采用GraphpadPrism 6软件进行统计分析，采用Student-t检验，所有测量或测定数据均重复3次以上，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血浆维生素D水平 饲养6周后，维生素D缺乏组的动物血浆维生素D浓度为42.71nmol／L，相比对照组显著下降。随饲养时间的进行，维生素D缺乏组的动物血浆维生素D浓度进一步降低，到第10周时，血浆维生素D浓度接近或低于检测下限（5nmol／L），平均浓度2.07nmol／L，大鼠处于维生素D缺乏状态。正常对照组与维生素D对照组的维生素D浓度在整个饲养过程中基本保持平稳，统计表明两组的维生素D浓度差异无统计学意义（P＝0.55）。见图1。

图1 各组大鼠血浆维生素D浓度

2.2 动物的生长曲线 实验开始后在不同时间点对大鼠体质量进行测量纪录。结果表明，正常对照组与维生素D对照组大鼠体质量差异无统计学意义（P＝0.53），正常饲料与维生素D对照饲料均可提供充足的营养，满足动物的日常生长需要。维生素D缺乏组大鼠体质量相比维生素D对照组较轻，但差异不显著（P＝0.14）。见图2。

图2 各组大鼠生长曲线

2.3 每日摄食量 在实验过程中对大鼠的饲料摄食量进行监测纪录。研究发现，在饲养开始时和饲养过程中，大鼠的每日摄食量在不同组别间差异无统计学意义；但是，在饲养第12周，维生素D缺乏组大鼠的每日摄食量低于维生素D对照组，但差异不显著（P＝0.08），见图3。

图3 各组大鼠每日摄食量

2.4 动物血压 维生素D缺乏大鼠建模成功后，通过颈动脉插管的方式对大鼠的血压进行测量。结果显示，维生素D缺乏组大鼠血压为（118.5±3.1）mm Hg，维生素D对照组和正常对照组分别为（113.5±3.7）mm Hg、（114.4±1.6）mm Hg。统计表明，维生素D缺乏组动物血压高于维生素D对照组（P＝0.046），维生素D对照组与正常对照组动物血压差异统计不显著（P＝0.55）。见图4。

图4 各组大鼠血压

3 讨 论

3.1 维生素D缺乏的原因 人体绝大部分维生素D是通过阳光照射自身合成获得，皮肤内的7-脱氢胆固醇经阳光中的紫外线照射变成维生素D3前体，然后在体内经过两次羟化作用后发挥生物效应。预防维生素D缺乏所需要的日光照射量难于确定，因为影响日光照射的因素很多，如季节、生活方式、空气污染、纬度等，同时皮肤颜色、衣着、防晒剂的使用等都会影响维生素D的合成。食物中富含维生素D的种类极少，含量也不高，单纯靠食物满足对维生素D的需求是不可能的；一项妊娠期间维生素D临床研究表明，典型的西方饮食每天提供的维生素D不多于200IU，不足以满足人体的生理需要。维生素D自身合成与饮食摄入不足是造成人体维生素D缺乏的主要原因。

3.2 维生素D缺乏与血压调节 维生素D水平与血压的关联已经有较多的流行病学研究。早期的研究发现［9］，纬度越高的地区，高血压发病率越高；纬度越高，阳光中的紫外线UV-B越少，维生素D的合成减少。此后，大量临床研究和调查表明，维生素D缺乏与高血压发病具有相关性，Martains等［10］和Scragg等［11］等分别对美国第3次全国健康与营养调查研究的数据分析显示，维生素D水平低者患高血压的风险较高，血清维生素D水平与血压呈明显的负相关。在一项评价维生素D补充对血压影响的随机双盲对照试验中，维生素D补充患者的收缩压和舒张压均有显著下降。本研究结果也表明，维生素D缺乏会导致血压显著升高。目前，维生素D缺乏导致血压升高的机制目前还不明确。Li等［12］的研究提示，维生素D是肾素-血管紧张素系统的负调控因子。维生素D可通过与VDR结合形成受体复合物入核，结合于肾素表达基因的上游，从而抑制肾素的表达。维生素D缺乏时，对肾素表达的抑制作用减弱，肾素的表达上调，从而增强血管紧张素的活性，一方面促进全身的血管收缩，另一方面通过醛固酮增加血容量，共同导致血压升高。此外，也有研究表明，维生素D也可通过作用于甲状旁腺激素系统、胰岛素拮抗、血管收缩、血管发生等机制参与血压的调节。

3.3 本实验动物模型的优点与合理性 此前的研究表明，人和动物体内的维生素D主要来自于自身合成和食物摄取。在本研究中，通过改变照明光源，切断动物体内维生素D的自身合成途径，同时给予维生素D缺乏饮食，经过6周的饲养，体内的维生素D储存被消耗，体内血浆维生素D水平开始下降，进一步到第10周时，动物进入维生素D缺乏状态；对动物的生长观察也发现，动物的生长、摄食情况没有显著改变。建模方法较简单，速度较快，指标直观容易检测。有研究表明，维生素D对婴幼儿的早期发育存在一定影响，维生素D缺乏与婴幼儿的许多骨性和非骨性疾病密切相关。因此，本研究选取成年的大鼠进行维生素D缺乏动物模型建立研究，可以更好地研究维生素D缺乏对于动物营养代谢、血压调节的影响，有利于阐明维生素D缺乏在高血压、心血管疾病等发生过程中的作用和机制。研究建立的维生素D缺乏动物模型建立方法相比常正奇等［13］的研究来说，方法简单易行，建模时间较短，重复性好，成功率高，是研究维生素D缺乏与疾病发生的一种相对较好的模型。

本文通过控制维生素D来源造成其缺乏，对高血压的深入研究有重要意义。但是，任何一种动物模型都不能完整模拟出所有的人类疾病表现，只能从一个侧面或一个方向对疾病发生进行认识。所以，在实际的研究工作中，要与临床研究相结合，才可能更好地、充分地发挥好动物模型在疾病研究中的作用。

［1］Rosen CJ.Clinical practice.Vitamin D insufficiency［J］.N Engl J Med，2011，364（3）：248-254.

［2］Singer T.Nutrition：The vitamin D complex［J］.Nature，2012，489（7417）：10-11.

［3］黄金，周智广.维生素D与代谢综合征关系的研究进展［J］.医学综述，2011，17（23）：3521-3523.

［4］吉薇，蒋雄京.维生素D与心血管疾病的研究进展［J］.临床药物治疗杂志，2012，10（1）：13-16，58.

［5］Mezza T，Muscogiuri G，Sorice GP，et al.Vitamin d deficiency：a new risk factor for type 2diabetes［J］.Ann Nutr Metab，2012，61（4）：337-348.

［6］Guessous I，Bochud M.Vitamin D and cardiovascular disease：epidemiological aspects［J］.Rev Med Suisse，2012，8（360）：2059-2060，2062-2065.

［7］Forrest KY，Stuhldreher WL.Prevalence and correlates of vitamin D deficiency in US adults［J］.Nutr Res，2011，31（1）：48-54.

［8］Wat WZ，Leung JY，Tam S，et al.Prevalence and impact of vitamin D insufficiency in southern Chinese adults［J］.Ann Nutr Metab，2007，51（1）：59-64.

［9］Rostand SG.Ultraviolet light may contribute to geographic and racial blood pressure differences［J］.Hypertension，1997，30（2Pt 1）：150-156.

［10］Martins D，Wolf M，Pan D，et al.Prevalence of cardiovascular risk factors and the serum levels of 25-hydroxyvitamin D in the United States：data from the third national health and nutrition examination survey［J］.Arch Int Med，2007，167（11）：1159-1165.

［11］Scragg R，Sowers M，Bell C.Serum 25-hydroxyvitamin D，ethnicity，and blood pressure in the third national health and nutrition examination survey［J］.Am J Hypertens，2007，20（7）：713-719.

［12］Li YC，Kong J，Wei M，et al.1，25-Dihydroxyvitamin D3 is a negative endocrine regulator of the renin-angiotensin system［J］.J Clin Invest，2002，110（2）：229-238.

［13］常正奇，张泽华，罗飞，等.维生素D缺乏动物模型的建立［J］.重庆医学，2011，40（11）：1041-1043.