仙鹤草水提液对SMMC-7721肝癌细胞的抗癌作用及其机制

邹夏慧，张焜和，陈 江，黄德强，祝金泉，朱 萱，吕农华

（南昌大学第一附属医院消化内科／江西省消化疾病研究所，南昌330006）

目前恶性肿瘤的药物治疗以化学药品为主，其开发费用昂贵，不良反应大。中草药是我国医药的一大特色，具有多靶点、多效应、毒副作用低、提高机体免疫力、调节内分泌功能、不易产生耐药性等独特优点，在肿瘤治疗中正日益受到重视［1］。仙鹤草是蔷薇科植物龙牙草（agrimonia pilosa ledeb，APL）的地上部分，含有酚、酯、黄酮、鞣质、糖苷、有机酸、挥发油、三萜皂苷等化学成分，具有抗肿瘤、降血糖、镇痛抗炎、止血等多方面的药理作用［2］。体外试验显示仙鹤草对胃癌、肠癌、食管癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌细胞株的生长都具有抑制作用［3-4］，配伍用于中药方剂治疗肺癌也有一定的临床疗效［5］。实验研究显示，仙鹤草体内外都具有显著的抗肝癌作用［6-8］，与介入治疗联合应用可提高肝癌的临床疗效［9］，也是慢性肝病中医临症的要药之一。因此，仙鹤草的抗肝癌作用值得深入研究。体外研究常用的人肝癌细胞株有SMMC-7721、HepG2和BEL-7402等，不同的肝癌细胞株具有不同的来源背景和生物学特性［10］，其中SMMC-7721肝癌细胞是建株于国人的中分化肝细胞癌，广泛应用于肝癌的实验研究。有关仙鹤草抗肝癌作用的实验研究主要限于HepG2和BEL-7402肝癌细胞系和一个研究组［6-8］。本研究观察仙鹤草水提液对人SMMC-7721肝癌细胞生长和凋亡的影响，并初步探讨其作用机制，旨在进一步为仙鹤草在肝癌治疗中的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仙鹤草水提液的制备 取中药仙鹤草100g，加入约10倍体积的蒸馏水，煮沸1h，取药液，再加等量的蒸馏水，煮沸1 h，取药液。合并两次药液，12 000r／min离心10min，取上清液浓缩为80mL，过滤除菌，4℃保存，使用前用RPMI 1640培养液（Hyclone公司）稀释为所需浓度。提取液按生药计为1.25g／mL。

1.2 SMMC-7721肝癌细胞复苏与传代培养 复苏SMMC-7721肝癌细胞（本研究所冻存），接种于含10%灭活胎牛血清（杭州四季青生物材料有限公司）的RPMI 1640培养液中，在37℃、5%CO2、饱和湿度下培养，24h后更换培养液。每天倒置显微镜下观察细胞，视生长情况每1～3天换液1次，并传代培养。

1.3 实验分组 按RPMI 1640培养液中的仙鹤草水提液浓度设4个实验组（5、10、20、40mg／mL组）进行实验，同时设立对照组（不加药液），于培养后24、48和72h分别观察仙鹤草水提液对SMMC-7721细胞的作用。

1.4 仙鹤草水提液对SMMC-7721肝癌细胞增殖的影响 将对数生长期的SMMC-7721细胞用0.25%胰蛋白酶（上海生工生物工程有限公司）溶液消化，收获细胞并用RPMI 1640培养液制成单细胞悬液，计数细胞，将细胞浓度调整为5×104／mL。以每孔104个细胞接种于96孔细胞培养板（Biofil公司），每组设4个复孔。待细胞生长良好，达孔底面积的2／3时，吸去培养液，加入不同浓度的仙鹤草水提液RPMI 1640培养液，继续培养。于培养24、48和72h时分别每孔加入噻唑蓝（MTT，北京奇华盛生物技术有限公司）溶液（5mg／mL）20μL，继续孵育4h，吸弃孔内培养液，加入150μL二甲基亚砜（DMSO，上海化学试剂厂），震荡10min，测定各孔光密度值（OD）。计算各组的平均OD值及细胞生长抑制率（IR）：IR＝［（对照组平均OD值-实验组平均OD值）／对照组平均OD值］×100%。实验重复3次，计算平均抑制率。根据MTT结果，选取有效浓度组及有效时间点进行后续试验。

1.5 仙鹤草水提液诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡的观察

1.5.1 形态学观察 根据 MTT结果，制备有效浓度组及有效时间点的细胞爬片，常规HE染色，光镜下观察结果。凋亡细胞表现为核染色质致密浓缩，核碎裂、边聚等，或可见凋亡小体。

1.5.2 流式细胞仪检测 采用膜联蛋白V（Annexin V）／碘化丙啶（PI）双染法检测细胞凋亡。消化收获仙鹤草水提液有效浓度组和时间点的细胞，制备单细胞悬液，按每管1×106个细胞分装于离心管中，加入5μL Annexin V、10μL PI、100μL工作缓冲液，混匀，4℃冰箱中放置30min，取出离心管，再加入400L工作缓冲液，用流式细胞仪（FACSC alibur型）测定细胞凋亡率。同时设立对照。

1.6 仙鹤草水提液对SMMC-7721肝癌细胞Bcl-2、P53蛋白表达的影响 分别制备仙鹤草水提液有效浓度组和有效时间点的细胞爬片。免疫细胞化学染色法检测Bcl-2蛋白和P53蛋白（鼠抗人Bcl-2蛋白单克隆抗体，鼠抗人P53蛋白单克隆抗体，免疫组化染色试剂盒均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品），操作步骤按试剂说明书进行。光镜下观察染色结果：Bcl-2蛋白阳性细胞表现为胞浆、胞膜着色呈棕黄色，P53蛋白阳性细胞表现为胞核着色呈棕黄色；每张爬片高倍镜下观察5个视野，计算阳性细胞率及其均值。

1.7 统计学处理 采用SPSS 13.0进行统计分析。组间OD值、阳性细胞率的差异比较采用单因素方差检验，两两比较采用LSD检测，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 仙鹤草水提液作用SMMC-7721肝癌细胞后MTT检测结果 不同浓度的仙鹤草水提液作用于SMMC-7721肝癌细胞后MTT法测定结果显示，5mg／mL组对细胞生长无明显抑制作用；10mg／mL组作用72h才出现弱抑制作用；20mg／mL组作用48h后出现抑制作用；40mg／mL组作用24h后即出现抑制作用，至72h时作用明显。见表1。

2.2 仙鹤草水提液作用SMMC-7721肝癌细胞后形态学观察结果 MTT结果显示20mg／mL组和40mg／mL组作用48h和72h后细胞生长活性受到明显抑制，故选择此两组的两个时间点制备相应的细胞爬片，HE染色后光镜观察。对照组细胞呈多边形、三角形或梭形，细胞均质而透明，胞核轮廓明显。仙鹤草作用组可见细胞凋亡的形态学特征：细胞核浓缩，核染色致密，可观察到新月体结构形成；高浓度药物作用后，细胞完全失去正常形态，胞核固缩明显。见图1。

2.3 仙鹤草水提液作用SMMC-7721肝癌细胞后流式细胞仪分析结果 选择对细胞生长抑制作用明显的20mg／mL组和40mg／mL组进行实验，Annexin V与PI双标记后进行流式细胞仪分析。结果显示，仙鹤草水提液作用48h和72h后可见较明显的细胞凋亡，20mg／mL组的细胞凋亡率分别为19.5%和23.2%，40mg／mL 组 的 细 胞 凋 亡 率 分 别 为 33.4% 和42.7%，对照组分别为4.0%和8.8%。

2.4 仙鹤草水提液作用SMMC-7721肝癌细胞后Bcl-2、P53蛋白表达的结果 仙鹤草水提液作用SMMC-7721肝癌细胞后，免疫细胞化学染色显示Bcl-2蛋白表达下调，而P53蛋白表达上调。见表2、图2。

表1 仙鹤草水提液对SMMC-7721肝癌细胞的生长抑制作用

图1 仙鹤草水提液作用SMMC-7721肝癌细胞后的形态学变化（HE染色×200）

图2 仙鹤草水提液作用后Bcl-2、P53蛋白免疫细胞化学染色结果（苏木精复染×200）

表2 仙鹤草水提液作用后Bcl-2、P53蛋白的表达率（±s）

表2 仙鹤草水提液作用后Bcl-2、P53蛋白的表达率（±s）

＊：P＜0.01，与同时间点对照组比较。

Bcl-2蛋白阳性细胞率（%）P53蛋白阳性细胞率（%）组别48h 72h 20mg／mL组 71.9±4.1＊ 58.5±5.3＊ 22.9±2.3＊ 50.6±4.0 48h 72h＊40mg／mL组 47.9±4.7＊ 26.5±5.7＊ 48.7±4.4＊ 83.7±3.2＊对照组93.4±4.5 85.8±3.0 8.8±0.5 9.2±1.3

3 讨 论

临床上中药最常用水煎剂。本研究采用煮沸加热方法提取仙鹤草中的有效成分进行抗肿瘤实验，贴近临床实用。有研究报道［11］，仙鹤草水提液没有急性毒性和遗传毒性，安全性好。

本研究采用仙鹤草水提液体外作用于SMMC-7721肝癌细胞，发现其具有较明显的抗肝癌细胞增殖作用。形态学观察可见细胞变小变圆，细胞数明显少于对照组。仙鹤草水提液对肝癌细胞的抑制呈现典型的时间和剂量依赖特点。

仙鹤草水提液作用SMMC-7721肝癌细胞后HE染色，光镜下可见细胞呈典型的凋亡形态学改变。进一步应用Annexin V／PI双染法流式细胞仪分析，实验组的细胞凋亡率明显高于对照组，并呈剂量和时间依赖性。表明诱导细胞凋亡，可能是仙鹤草抗肝癌细胞的主要机制之一。凋亡受阻是肿瘤的发生机制之一。研究表明，不少抗肿瘤中药都可通过干扰肿瘤细胞生长、代谢、增殖等过程，最终触发肿瘤细胞凋亡来达到治疗目的［1］。调控细胞凋亡的相关基因很多，其中Bcl-2和P53为两个经典的凋亡相关基因，前者抑制细胞凋亡，后者促进细胞凋亡。Bcl-2蛋白可能是通过防止线粒体通透性改变，阻止细胞色素C释放等一系列凋亡级联反应，从而抑制凋亡［12］。野生型P53是重要的细胞周期与细胞凋亡调控基因之一，参与维持细胞周期的正常运行，保证DNA复制的精密性［13］。

常态下的SMMC-7721肝癌细胞Bcl-2蛋白过表达［14］，P53蛋白为恒量表达，未发现该细胞株存在P53基因突变，而凋亡增加时，Bcl-2蛋白表达下调，P53蛋白上调［15］。本研究结果显示，仙鹤草水提液作用SMMC-7721肝癌细胞后，Bcl-2蛋白表达明显下降，P53蛋白的表达明显升高，且呈剂量、时间依赖性，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。提示仙鹤草诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡可能是通过下调抗凋亡基因Bcl-2表达、上调抑癌基因P53表达来实现的。

综上所述，仙鹤草水提液达到一定浓度时，在体外能明显的抑制SMMC-7721肝癌细胞增殖，诱导细胞凋亡可能是其效用的基础，凋亡机制可能与Bcl-2蛋白表达下调和P53蛋白表达上调有关。深入研究仙鹤草的抗肝癌作用及其分子机制，对于促进其在肝癌治疗的应用和丰富肝癌的临床治疗方法具有重要意义。

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