赖氨酰氧化酶与乳腺癌侵袭转移相关因子的研究＊

杨华伟，刘剑仑，李景涛，刘起鹏，韦 薇，唐 玮，蒋 奕

（广西医科大学附属肿瘤医院乳腺科，南宁530021）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其复发转移是乳腺癌死亡的最主要原因［1］。近年来的研究发现，赖氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX）的表达异常与乳腺癌的侵袭转移密切相关［2］。但LOX在乳腺癌侵袭转移中的作用机制尚不清楚。本研究组前期结果提示，LOX可以促进乳腺癌的侵袭转移，LOX基因在高侵袭潜能的乳腺癌细胞MDA-MB-231中高表达，在低侵袭性MCF-7细胞中低表达［3］。本研究通过构建LOX慢病毒干扰载体（LOX-RNAi-LV），抑制高侵袭转移乳腺癌细胞MDA-MB-231中LOX基因表达，并检测LOX、基质金属蛋白酶-2（matrixmetalloproteinases-2，MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和 低 氧 诱 导 因 子-1α（hypoxia-inducible factor-1α（HIF-1α）的表达变化，通过乳腺癌裸鼠移植瘤模型分析LOX蛋白与MMP-2、MMP-9及HIF-1α蛋白相关性，探讨LOX在乳腺癌侵袭转移中可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人乳腺癌细胞MDA-MB-231购于南京凯基生物技术有限公司；人乳腺癌MCF-7细胞由广西医科大学基础实验室馈赠；LOX-RNAi-LV由上海吉凯基因化学技术有限公司构建包装；Trizol Reagent购自美国Invitrogen公司；Quant SYBR Green PCR试剂盒为北京TianGen公司产品；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；荧光定量PCR为美国Bio-Rad，iQTM5Multicolor；LOX兔抗人多克隆抗体购自美国Novus生物公司；病理图像分析仪DMR＋550为德国莱卡公司。

1.2 LOX-RNAi-LV的构建 由Ambition公司设计、合成针对人LOX基因的siRNA，序列如下，上游引物：GGA ACU UUA GUG AAA CAU AAU，下游引物：UAU GUU UCA CUA AAG UUC CAG。合成含干扰序列的双链DNA oligo，其两端含酶切位点粘端，直接连入酶切后的载体pGCL-GFP（含U6启动子）上。验证后进行病毒包装，检测滴度和复感染指数后进行细胞转染干扰实验。

1.3 细胞培养及转染 人乳腺癌细胞MDA-MB-231培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，37℃、5%CO2的恒温箱中培养。将处于对数生长期的3×105个细胞／孔接种于6孔板中，待细胞覆盖率达70%时进行转染，干扰组加入1.5×108TU／mL病毒液LOX-RNAi-LV 30μL，阴性对照组加入1.5×108TU／mL GFP-NC-LV 30μL，空白对照组除不作转染外其余处理与以上各组相同。每组设3个平行孔，分别于感染24、48、72、96h后，观察荧光表达情况。

1.4 转染72h后实时荧光定量PCR检测LOX mRNA，MMP-2mRNA，MMP-9mRNA及HIF-1αmRNA表达 Trizol法提取各组细胞总RNA，检测细胞总RNA浓度，取2μg总RNA逆转录合成cDNA。引物序列：MMP-2上游引物：TGC CCA AGA ATA GAT GCT GAC，下游引物：GAA AGG AGA AGA GCC TGA AGT G，长度160bp；MMP-9上游引物：CTT CTG CCC GGA CCA AGG ATA C，下游引物：TTC AGG GCG AGG ACC ATA GAG G，长度187bp；HIF-1α，上游引物：CCA GTT ACG TTC CTT CGA TCA GT，下游引物：TTT GAG GAC TTG CGC TTT CA，长度74bp；LOX上游引物：CAG GCA CCG ACC TGG ATA TGG，下游引物：CGT ACG TGG ATG CCT GGA TGT AGT，长度193bp；β-actin上游引物：AGT TGC GTT ACA CCC TTT CTT G，下游引物：CAC CTT CAC CGT TCC AGT TTT，长度148bp。Real-time PCR按Quant SYBR Green PCR试剂盒说明书操作，每例样品各做3个平行管，在实时荧光定量基因扩增仪进行扩增。反应条件：MMP-2：预变性95℃2min，变性95℃30s，退火58℃30s，40个循环，延伸72℃31s。MMP-9：预变性95℃5min，变性95℃45s，退火59℃30s，40个循环，延伸72℃31s。HIF-1α：预变性95℃3min，变性95℃30s，退火57℃30s，40个循环，延伸72℃31s。LOX：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火59℃30s，40个循环，72℃31s。读取Ct值，参照文献比较阈值法计算［4］：首先按公式“△Ct＝CT平均值（LOX）-CT平均值（β-actin）”分别计算对照组和干扰组的△CT，再按公式“ΔΔCT＝ΔCT干扰组-ΔCT对照组”得到“2-ΔΔCT”代 表目 的 基 因 相 对 表达 量。（1-2-ΔΔCT）×100% 为LOX基因表达抑制率。

1.5 转染72h后 Western blot检测LOX蛋白表达 提取MDA-MB-231细胞总蛋白，操作步骤按照RIPA裂解液使用说明进行，并用BCA法测定蛋白浓度。取10μL约30μg的总蛋白进行10%SDS-PAGE电泳后，湿法转至PVDF膜上，一抗、二抗标记，电化学发光法显影。LOX蛋白与β-actin蛋白条带的灰度比值反映LOX蛋白的相对表达水平。

1.6 乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型的建立 实验裸鼠随机分为3组，每组20只，分别接种MDA-MB-231、MCF-7及干扰LOX基因表达的MDA-MB-231细胞［3］。取对数生长的上述3种细胞，细胞浓度为1.0×108／mL。抽取3种细胞悬液各0.1mL分别注入60只祼鼠的乳腺脂肪垫内。接种后6周，裸鼠颈椎脱位致死做后续试验。

1.7 免疫组织化学法检测LOX、MMP-2、MMP-9及 HIF-1α蛋白表达 免疫组织化学采用标记的链霉素抗生物素蛋白-生物素免疫染色（streptavidin peroxidase，SP）方法，实验步骤按说明书进行。以已知阳性切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.8 免疫组织化学染色结果判断 LOX、MMP-2及 MMP-9染色以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性，HIF-1α蛋白的表达部位主要在细胞核，呈棕黄色颗粒为阳性。随机选择10个高倍（×400）视野，根据肿瘤细胞着色数量多少，半定量分为4级：无着色为阴性（-），阳性细胞小于25%为弱阳性，阳性细胞25%～50%为中度阳性（＋＋），阳性细胞大于50%为强阳性（＋＋＋）。

1.9 统计学处理 应用SPSS13.0软件对数据进行统计学分析，数据均以±s表示。采用配对样本t检验、Spearman等级相关、两独立样本比较的Wilcoxon秩和检验、多个独立样本比较Kruskal-Wallis H秩和检验进行分析，检验水准α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 慢病毒转染效率的检测 LOX-RNAi-LV转染乳腺癌细胞株MDA-MB-231，60h后有GFP荧光表达，72h后表达明显增强，荧光表达率达90%。

2.2 实时荧光定量PCR检测各组LOX mRNA、MMP-2mRNA、MMP-9mRNA及HIF-1αmRNA表达 样品mRNA经逆转录，实时荧光定量PCR仪分析获得目的基因和内参β-actin扩增片段的Ct值、扩增曲线和融解曲线。转染72h后，转染组LOX mRNA相对表达量与空白组比较，干扰组的LOX mRNA被抑制，抑制率达89.2%，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。实时荧光定量PCR结果显示，干扰组MMP-2、MMP-9mRNA相对表达量均明显低于阴性组和空白组，差异有统计学意义（P＝0.000）。

图1 Western blot检测转染LOX-RNAi-LV后各组LOX蛋白的表达情况

表1 各组LOX蛋白表达水平（±s）

表1 各组LOX蛋白表达水平（±s）

＊：P＜0.05，与阴性对照组及空白组比较。

组别 条带光密度相对比值LOX／β-actin转染组 0.156±0.004＊空白组 0.916±0.007阴性对照组0.696±0.020

2.3 Western blot检测各组LOX蛋白表达 转染72h后，干扰组的LOX蛋白水平与空白组和阴性对照组比较明显被抑制，抑制率达82.97%（图1、表1）。

2.4 免疫组织化学法检测LOX及相关因子的蛋白表达 取体内裸鼠移植瘤标本，用免疫组织化学法分别检测MDA-MB-231组、MDA-MB-23（LOX干扰）组、MCF-7组中LOX、MMP-2、MMP-9及HIF-1α蛋白的表达情况。

2.4.1 LOX蛋白在裸鼠移植瘤组织中的表达 LOX蛋白主要表达于胞核、胞浆中出现棕色颗粒为阳性（图2），LOX蛋白在 MDA-MB-231组、MDA-MB-231（LOX干扰）组、MCF-7组中表达情况，见表2。

表2 LOX、MMP-2、MMP-9、HIF-1а蛋白在3组的表达情况 比较

2.4.2 MMP-2蛋白在裸鼠移植瘤组织中的表达 MMP-2蛋白主要表达在细胞浆（图3）。MMP-2蛋白在 MDA-MB-231组、MDA-MB-231（LOX干扰）组、MCF-7组中的表达情况，见表2。

2.4.3 MMP-9蛋白在裸鼠移植瘤组织中的表达 MMP-9蛋白主要表达在细胞浆。MMP-9蛋白在MDA-MB-231组、MDA-MB-231（LOX干扰）组、MCF-7组中的表达情况，见表2。

图2 裸鼠移植瘤LOX（＋＋＋）阳性表达免疫组织化学影像学表现（SP，×400）

2.4.4 HIF-1α蛋白在裸鼠移植瘤组织中的表达 HIF-1α蛋白的表达部位主要在细胞核。HIF-1α蛋白在 MDA-MB-231组、MDA-MB-231（LOX干扰）组、MCF-7组中的表达情况，见表2。

2.5 LOX蛋白与 MMP-2、MMP-9及HIF-1α蛋白的相关性 Spearman相关分析显示LOX蛋白与 MMP-2（r＝0.696，P＝0.000）、MMP-9（r＝0.735，P＝0.000）、HIF-1α（r＝0.737，P＝0.000）蛋白呈显著正相关。

图3 裸鼠移植瘤MMP-2（＋＋＋）阳性表达免疫组织化学影像学表现（SP，×400）

3 讨 论

LOX是一种铜依赖性氧化酶，是细胞外基质中胶原与弹性蛋白聚合起始阶段并稳定细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的关键酶［5］。研究表明LOX表达与乳腺癌的复发转移有关［6］，在乳腺癌、食管癌、头颈部恶性肿瘤和黑色素瘤中高表达［7-9］。肿瘤细胞中表达上调的LOX，能够促进肿瘤细胞扩散到其他组织器官，肿瘤组织缺氧提示癌细胞的生长和分裂速度快，HIF-1可诱导LOX mRNA活性增高，可能是导致癌细胞侵袭转移的主要原因［10］。肿瘤细胞实现其侵袭转移必须解除细胞外基质的束缚，这有赖于基质金属蛋白酶（matrix metallo-proteinases，MMPs）、组 织 蛋 白 酶 （cathepsins）等，MMP-2、MMP-9能降解Ⅳ型胶原，MMPs促进乳腺癌浸润和转移的机制与降解细胞外基质、促进血管生成及调节细胞黏附有关，而MMP-2和MMP-9蛋白的高表达使其相应的特异性抑制剂的表达失去平衡，导致基底膜的主要成分（Ⅳ型、Ⅶ型、Ⅹ型胶原和明胶）被降解［11-12］。Erler等［13-14］不但发现侵袭转移性乳腺癌细胞株中LOX表达上调，LOX反义寡聚核苷酸或LOX小分子抑制剂能抑制乳腺癌细胞株的侵袭能力，还发现LOX不仅介导了侵袭转移性乳腺癌细胞株MDA-MB-231对胶原Ⅰ基质的侵袭作用，而且引起MMPs的活性增强，同时发现乳腺癌、头颈癌患者肿瘤组织的低氧状况与LOX表达水平明显相关，认为LOX mRNA通过LOX启动子中功能性低氧反应元件受到HIF-1α的调控。LOX可能是一个低氧反应基因［15］。

本研究采用LOX-RNAi-LV稳定转染MDA-MB-231细胞后，干扰组LOX mRNA和LOX蛋白与阴性对照组和空白对照组比较差异有统计学意义，说明LOX-RNAi-LV转染后MDA-MB-231细胞LOX mRNA和LOX蛋白表达受到显著抑制。同时，实时荧光定量PCR检测结果显示，干扰组MMP-2、MMP-9及HIF-1α及基因表达与空白组和阴性对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），说明抑制了LOX的表达其MMP-2及MMP-9、HIF-1α及Ki-67的表达同时也受到了明显的抑制；乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7和LOX基因干扰的裸鼠移植瘤模型中 MDA-MB-231组LOX、MMP-2、MMP-9及HIF-1α蛋白表达水平明显高于LOX基因干扰组及MCF-7组，而且LOX的表达与 MMP-2、MMP-9及HIF-1α成显著正相关。

作者推测可能是由于MMPs水解ECM，松解了致密的胶原基质结构，促进肿瘤细胞移行，而LOX的过表达改变了肿瘤细胞外基质的结构，激活某些特定信号传导通路，上调了MMPs的表达，MMPs通过降解基底膜，去除了肿瘤细胞侵蚀和转移的物理屏障，破坏了血管壁的完整性，同时增加了微血管的通透性，介导内皮细胞迁移和侵蚀，诱导新生血管形成，从而促进了乳腺癌的侵袭转移；而且低氧环境影响下上调LOX的表达，刺激乳腺癌细胞发生侵袭转移。LOX和 MMP-2、MMP-9及HIF-1α转移因子可能具有协同促进作用，促进了乳腺癌的侵袭转移。因此，进一步探索LOX在乳腺癌侵袭转移中的可能作用机制，将有助于更好地阐述乳腺癌的生物学行为。

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