人参皂苷Rbl对大鼠脑缺血再灌注JAK2／STAT3信号转导通路的影响＊

余 录，胡光强，陈碧琼，涂 华，杨朝鲜

（泸州医学院：1.基础医学院；2.神经生物研究室，四川泸州646000）

脑卒中为目前世界上致死率和致残率排名第2位的疾病［1］，缺血性脑卒中占卒中病例的70%～80%，是脑卒中的主要类型，严重威胁人类健康与生命安全。因此，开发安全、有效的治疗药物、寻找确切的治疗靶点已是当前迫切需要。人参是中国传统中药之精品，人参皂苷（ginsenoside，GR）是人参的主要有效成分，在临床上尤其是神经科得到广泛的应用。GR按苷元的不同分多种类型，其中，GRbl含量最为丰富。研究表明，GRbl能通过抗炎、抗氧化、抗凋亡等保护脑缺血再灌注损伤。Janus激酶／信号转导和转录激活因子（Janus kinases／signal transducers and activators of transcription，JAKs／STATs）是细胞因子及氧化应激的一条重要的胞内信号转导途径，与脑缺血等中枢神经系统疾病的病理生理过程密切相关［2］。本实验通过建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注（MCAO／R）模型，探讨GRbl对JAK2／STAT 3胞内信号通路的影响，明确其保护机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与试剂 GRbl（纯度大于或等于98%，白色粉末，批号：ZL20100705A），由南京泽朗植提技术有限公司提供。磷酸化JAK2多克隆抗体，磷酸化STAT3单克隆抗体（Santa Cruz公司产品）。SABC试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），TNF-α、IL-6ELISA试剂盒（北京环亚泰克生物医学技术有限公司）；考马斯亮兰蛋白测定试剂盒（南京建成生物工程研究所），其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 实验动物及分组 雄性SD大鼠，体质量250～300g，购自第三军医大学动物饲养中心。随机分为4组：假手术组、溶媒组、GRbl高剂量组（40mg／kg）、GRbl低剂量组（20mg／kg）。假手术组和溶媒组给予等量的生理盐水，药物和溶媒均在再灌时立即腹腔注射。

1.2 方法

1.2.1 MCAO／R模型的建立 大鼠用10%水合氯醛（350 mg／kg）腹腔注射麻醉后，将其仰卧固定于手术台上，从颈部正中切口，依次小心分离右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）及颈内动脉（ICA），结扎并剪断ECA，在ECA近分叉处用眼科手术剪剪一小口，从ECA往ICA插入制备好的栓线，栓线头端圆润，直径约0.34mm，插入深度为18～20mm，感到有阻力时停止插入，然后将栓线尾端固定于ECA上，逐层缝合肌肉皮肤。缺血2h后，将栓线头端拉出实现再灌注。术中由红外灯照射使大鼠体温维持在37℃。假手术组除不插入线栓外，其余步骤相同。

1.2.2 神经行为学评分 缺血后2h，参照Longa等［3］方法对大鼠进行神经功能缺失评分。0分：无任何神经功能缺损；1分：右前肢不能完全伸展；2分：向左侧转圈；3分：行走或静止时向左侧倾倒；4分：不能自主活动；5分：死亡。在初次评分后满足1～3分的大鼠纳入后继的实验组。再灌注后24h，再次对大鼠进行神经行为学评分并进行统计学处理。

1.2.3 TNF-α、IL-6的含量测定 每组8只大鼠，再灌24h后，将大鼠麻醉，剖开胸腔，剪破右心耳，用生理盐水从左心室灌流至流出液为澄清，取出大脑缺血侧-80℃保存，测定前称重，以1∶10比例加入冰生理盐水匀浆，3 500r／min离心15min，取出上清液，严格按照ELISA试剂盒说明书检测TNF-α、IL-6的含量。

1.2.4 p-JAK2和p-STAT3免疫组织化学的检测 每组4只大鼠，再灌注24h后，先用冰冻的PBS溶液（pH为7.2～7.4）约200mL快速灌流，再用4%的多聚甲醛溶液灌流。然后迅速剪开颅骨，取出大脑，用10%中性甲醛固定24～48h，从大脑前囟-2.3mm处向后切取厚约3mm的冠状脑组织，用石蜡包埋，制作厚度约5μm的脑部冠状切片，用于免疫组织化学染色。免疫组织化学采用SABC法。将石蜡切片脱蜡、复水，3%的H2O2灭活内源性过氧化物酶，然后用微波进行抗原修复、5%BSA液封闭，清洗后加一抗（p-JAK2和p-STAT3），37℃孵育2h，移置于4℃冰箱过夜。加二抗孵育1h，清洗后滴加SABC，37℃孵育1h后，清洗。DAB显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化、氨水返蓝、脱水封片。

1.3 统计学处理 免疫组织化学染色后，取缺血侧皮层额叶4个不重叠的区域采图，然后用Image Pro-plus5.0软件分析免疫组织化学阳性表达的累积光密度值（IOD）并计算每组平均值。所有实验数据以±s表示，实验结果采用SPSS16.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析的方法进行，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 GRbl对缺血再灌注大鼠神经行为学评分的影响 再灌24 h后，大鼠出现明显的神经运动功能障碍，其主要表现为Horner综合征即右侧瞳孔缩小、眼睑下垂、眼裂狭小甚至眼底出血呈红肿，肢体障碍即提尾时左前肢内收、肩内旋、肌张力明显降低，爬行时向右侧划圈、追尾，甚至倾倒或不能自行行走。与溶媒组比较，GRbl高剂量组神经行为学评分明显降低（P＜0.05），GRbl低剂量组评分也有所降低，但差异无统计学意义，见表1。

2.2 GRbl对脑缺血再灌注大鼠脑组织中TNF-α和IL-6的影响 缺血2h再灌注24h后，溶媒组TNF-α、IL-6含量明显增高。与溶媒组比较，GRbl低剂量组、高剂量组TNF-α含量均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），IL-6的含量也有所降低，其中，高剂组显示差异有统计学意义（P＜0.05），结果见表2。

表1 GRbl对脑缺血再灌注大鼠神经功能评分的影响（±s，n＝12）

表1 GRbl对脑缺血再灌注大鼠神经功能评分的影响（±s，n＝12）

＊：P＜0.05，与溶媒组比较。

组别 神经行为学评分假手术组0.00±0.00溶媒组 2.75±0.96 GRbl低剂量组 2.28±0.51 GRbl高剂量组 1.66±0.65＊

表2 各组大鼠脑组织中TNF-α、IL-6的含量比较（±s，n＝8）

表2 各组大鼠脑组织中TNF-α、IL-6的含量比较（±s，n＝8）

＊：P＜0.05，＊＊：P＜0.01，与溶媒组比较。

组别 TNF-α含量（pg／g.pro）IL-6的含量（pg／g.pro）假手术组 75.83±9.20＊＊ 44.67±16.42＊＊溶媒组 142.18±22.43 82.41±21.33 GRbl低剂量组 120.35±17.04＊ 75.58±23.09 GRbl高剂量组 98.29±20.62＊＊ 61.42±16.67＊＊

图1 p-JAK2和p-STAT3免疫组织化学染色影像学表现（×400）

2.3 GRbl对大鼠脑缺血再灌注损伤后p-JAK2，p-STAT3表达的影响 假手术组未见p-JAK2和p-STAT3免疫阳性细胞的表达，而在溶媒组可见到缺血侧大量的深棕色阳性细胞的表达，主要集中在缺血半暗带，在缺血核心区也有少量表达。GRbl高剂量组、低剂量组p-JAK2和p-STAT3蛋白表达量明显减少（P＜0.05或P＜0.01），结果见图1～2。

图2 p-JAK2和p-STAT3免疫组织化学染色阳性表达累积光密度值

3 讨 论

缺血性卒中损伤涉及的病理机制极为复杂。诸多证据显示，炎症事件介导缺血再灌注损伤的病理进程［4］。炎症级联反应中，细胞因子、转录因子等扮演着重要角色，最终导致神经损伤与功能障碍。JAKs／STATs是细胞因子、氧化应激等介导的重要胞内信号转导途径［5］。JAKs蛋白家族包括JAK1、JAK2、JAK3、TYK2，而 STATs 蛋 白 家 族 包 括 STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6。其中JAK2／STAT3与脑缺血密切相关。脑缺血及再灌注损伤导致大量炎性细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6），生长因子以及活性氧的产生和释放，这些因子与特异受体结合激活JAKs使其酪氨酸残基磷酸化，识别STATs的SH2区域并转移至细胞核，调节靶基因的表达，引起白细胞聚集于梗死外周区域，进一步参与迟发性炎性反应，导致神经毒性作用，造成恶性循环。

人参是珍贵的多年生草本植物，具有补气生血、安神益智、生津止渴之功效。GR是人参、三七等中药材的主要有效成分，在临床上尤其是神经科得到广泛的应用。GR按二元的结构可分为齐墩果酸型、原人参二醇型（如Rb1、R3）和原人参三醇型（Rg1），GRbl是其中含量最丰富的人参皂苷单体之一，其具有广泛的药理学活性，作用于中枢神经系统、心血管系统、免疫系统等［6］。研究表明，GRbl能通过抗凋亡等保护脑缺血再灌注损伤［7-8］，而缺血后JAK2／STAT3信号通路异常激活导致神经元凋亡的发生，应用JAK2特异性抑制剂AG490阻断JAK2和STAT3的磷酸化，而且具有抗细胞凋亡作用［9］。GRbl能抑制缺血再灌注炎性反应［10］，而IL-6、活性氧是选择性激活JAK2／STAT1、STAT3的细胞因子。有研究发现，GRbl通过JNK／p38MAPK信号途径减轻神经元tau蛋白的过度磷酸化，而阻断MAPK的作用后，STAT的转录活性明显降低，表明 MAPK可能激活STAT的转录活性［11］。因此，GRbl有可能作用于脑缺血损伤中的JAK2／STAT3信号通路。

本实验研究发现，大脑缺血2h再灌24h后，大鼠有明显的神经行为学缺失症状，缺血侧脑组织可见明显的水肿以及苍白色的梗死灶，脑组织中细胞因子TNF-α、IL-6的含量明显增加。Acalovschi等［12］研究表明，IL-6加重脑缺血损伤，其水平与脑梗死体积相关，是神经功能恶化的预警器。本实验免疫组织化学染色发现，缺血侧皮层p-JAK2和p-STAT3免疫阳性表达提高，而先前文献报道，缺血再灌注24h，磷酸化STAT3蛋白在缺血半暗带区达高峰。本实验在给予人参皂苷处理后，大鼠神经功能障碍减轻，脑组织中炎性细胞因子TNF-α、IL-6含量降低，p-JAK2和p-STAT3的表达也明显减少，表明GRbl可能通过抑制细胞因子介导的JAK2／STAT3信号途径保护脑缺血再灌注损伤。

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