叶黄素对体外培养的人食管癌Ec-9706细胞增殖和凋亡的影响

李 莉，任广伟，赵 昱，龚 淼，孟 丽，高福禄

（1.河北医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室，河北石家庄050017；2.河北医科大学第一医院肾内科，河北石家庄050031；3.河北师范大学生命科学院，河北石家庄050024）

·论 著·

叶黄素对体外培养的人食管癌Ec-9706细胞增殖和凋亡的影响

李 莉1，任广伟2，赵 昱1，龚 淼1，孟 丽1，高福禄3*

（1.河北医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室，河北石家庄050017；2.河北医科大学第一医院肾内科，河北石家庄050031；3.河北师范大学生命科学院，河北石家庄050024）

目的探讨叶黄素对体外培养的人食管癌9706细胞（esophageal carcinoma 9706，Ec-9706）增殖和细胞凋亡的影响。方法将Ec-9706细胞用含10%胎牛血清的RPMIl640培养基于37℃、5%CO2/95%空气饱和湿度培养箱中培养。采用随机数字表法，将其随机分为4组：对照组（C组）和不同浓度叶黄素组（L1～3组）。L1～3组分别加入40、80和160μmol/L叶黄素；C组加入等体积RPMI1640培养液。采用噻唑兰法检测不同浓度叶黄素对人食管癌Ec-9706细胞增殖的影响；采用流式细胞术检测Ec-9706细胞凋亡情况；采用免疫细胞化学方法检测Fas、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、cyclin D1和Caspase-3蛋白的表达。结果叶黄素可抑制Ec-9706细胞的增殖，诱导Ec-9706细胞的凋亡，且呈剂量依赖性。叶黄素可下调Ec-9706细胞PCNA和cyclin D1蛋白表达，上调Fas和Caspase-3蛋白表达，且呈剂量依赖性。结论叶黄素可抑制体外培养的人食管癌Ec-9706细胞的增殖，诱导其凋亡，且呈浓度依赖性，其机制与下调PCNA和cyclin D1蛋白表达，上调Fas和Caspase-3蛋白表达有关。

食管肿瘤；细胞增殖；细胞凋亡；叶黄素

叶黄素是广泛存在于自然界植物中的一种含氧类胡萝卜素。流行病学和动物实验研究表明，叶黄素在视觉保护、增强免疫功能、预防慢性病和降低癌症发生等方面有广泛的生物学活性［1］。有研究［2］表明，叶黄素在抗消化道肿瘤方面有显著作用，尤其是食管癌。但其机制尚未见报道。本研究拟探讨叶黄素对体外培养的人食管癌9706细胞（esophageal carcinoma 9706，Ec-9706）增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂和仪器：RPMI1640培养基（Gibco公司，美国），胎牛血清（杭州四季青生物制品公司），噻唑兰和碘化丙啶荧光染料（Sigma公司，美国），兔抗人 Fas抗体、兔抗人增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗体、兔抗人cyclin D1抗体和兔抗人Caspase-3抗体、SP试剂盒和二氨基联苯胺试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），叶黄素（Sigma公司，美国），胰蛋白酶（Sigma公司，美国）；HF-212UV CO2恒温培养箱（上海一恒科技有限公司），Motic AE31倒置显微镜（Motic公司，德国），DG5031型酶联免疫检测仪（上海华东电子集团医疗装备公司），Epics-XLⅡ型流式细胞仪（Beckman Coulter公司，美国）。

1.1.2 细胞株：Ec-9706细胞株由中国医学科学院肿瘤研究所建系，本实验室冻存。将Ec-9706细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基于37℃、5%CO2/95%空气饱和湿度培养箱中培养，每天用0.25%胰酶消化，以1∶2传代1次。

1.2 方法

1.2.1 叶黄素溶液的配制：实验前将叶黄素用1mL二甲基亚砜充分溶解，用 RPMI1640培养液配成终浓度为320μmol/L的母液，4℃冰箱避光保存备用。

1.2.2 实验分组：采用随机数字表法，将其随机分为4组，即对照组（C组）和不同浓度叶黄素组（L1～3组）。L1～3组分别加入40、80和160μmol/L叶黄素；C组加入等体积RPMI1640培养液。

1.2.3 叶黄素对Ec-9706细胞增殖影响的测定：取对数生长期的Ec-9706细胞和正常人外周血单个核细胞，接种于96孔培养板中，每孔滴加200μL单细胞悬液，使每孔含1.7×103个细胞，设8个复孔，同时接种6个96孔板，常规培养24 h。分别在孵育24、48和72h，取出2块培养板，每孔滴加噻唑兰溶液（5g/L）20μL，37℃培养箱孵育4 h后终止培养。弃上清，每孔滴加二甲基亚砜200μL，振荡15 min。酶标仪在570 nm处测定各孔吸光度，计算细胞增殖抑制率 =（1-实验组吸光度值/对照组吸光度值）×100%。

1.2.4 叶黄素对Ec-9706细胞凋亡影响的测定：取12瓶对数生长期 Ec-9706细胞，分别于24、48和72h取出不同药物浓度细胞4瓶，收集细胞分别放入4个15mL离心管内标记后进行离心，制成浓度为7×108个/L的单细胞悬液离心后弃上清液缓慢加入预冷70%无水乙醇7mL，4℃过夜。采用碘化丙啶单染法，每份样品中加入鸡红细胞作为内参标准，与样品同步染色，每份样品中加入1mL碘化丙啶染液，在4℃避光孵育30min。用488nm氩离子激光器激发由630nm带通滤光片接收，通过散点图收集10 000个细胞，分析碘化丙啶荧光直方图上凋亡细胞百分率。

1.2.5 Fas、PCNA、cyclin D1和Caspase-3蛋白表达的测定：取对数生长期细胞制成浓度为1×107个/L的单细胞悬液，接种到放有盖玻片的6孔板，培养箱孵育24h，使细胞贴壁于盖玻片上。分别于孵育24、48和72h后取出盖玻片，SP法进行免疫细胞化学染色，3%甲醇-H2O2室温处理10min，微波抗原修复（9℃）15min。免疫细胞化学染色。用已知阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。采用图像分析系统进行定量分析，每张玻片随机取5个高倍视野，测定特异性着色的积分光密度值，反映目的蛋白的表达水平。

1.3 统计学方法：应用SPSS13.0统计学软件进行数据分析，计量资料以±s表示，分别采用单因素方差分析和q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 叶黄素对Ec-9706细胞增殖的影响：与C组比较，L1～3组细胞增殖抑制率升高，且呈浓度依赖性，见表1。

表1 4组Ec-9706细胞增殖抑制率比较Table 1 Comparison of inhibitory rate of Ec-9706 cells proliferation in 4 groups（n=7，±s，%）

表1 4组Ec-9706细胞增殖抑制率比较Table 1 Comparison of inhibitory rate of Ec-9706 cells proliferation in 4 groups（n=7，±s，%）

*P＜0.05 vs group C #P＜0.05 vs group L1△P＜0.05 vs group L2by q test

Groups 24h 48h 72h C ---L1 3.0±0.4 27.5±1.9* 48.9±2.2*L2 11.2±0.3*# 41.9±2.7*# 64.7±2.9*#L3 30.3±1.0*#△ 78.2±3.0*#△ 85.7±3.8*#△

2.2 叶黄对Ec-9706细胞凋亡的影响：与C组比较，L1～3组细胞凋亡率升高，且呈浓度依赖性（P＜0.05），见表2。

表2 4组Ec-9706细胞凋亡率比较Table 2 Comparison of apoptosis rate of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=3，±s，%）

表2 4组Ec-9706细胞凋亡率比较Table 2 Comparison of apoptosis rate of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=3，±s，%）

*P＜0.05 vs group C #P＜0.05 vs group L1△P＜0.05 vs group L2by q test

Groups 24h 48h 72h C 1.9±0.6 3.8±1.1 4.0±0.9 L1 8.7±0.9* 14.2±1.3* 42.3±2.1*L2 12.8±1.0* 35.4±2.0*# 63.0±1.3*#L3 28.1±1.2*#△ 67.3±3.3*#△ 75.6±3.0*#△

2.3 叶黄素对Ec-9706细胞Fas、Caspase-3、PCNA、cyclin D1蛋白表达的影响：与C组比较，L1～3组细胞 PCNA和 cyclin D1蛋白表达下调，Fas和Caspase-3蛋白表达上调，且呈浓度依赖性（P＜0.05），见表3～6。

表3 4组Ec-9706细胞PCNA蛋白表达比较Table 3 Comparison of PCNA protein expression of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=5，±s，OD）

表3 4组Ec-9706细胞PCNA蛋白表达比较Table 3 Comparison of PCNA protein expression of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=5，±s，OD）

*P＜0.05 vs group C #P＜0.05 vs group L1△P＜0.05 vs group L2by q test

Groups 24h 48h 72h C 90.5±2.3 91.9±1.6 91.4±2.1 L1 86.2±1.7 80.5±1.0* 77.3±1.4*L2 80.3±1.2 72.3±1.8*# 69.4±1.7*#L3 69.7±1.1*#△ 65.0±1.2*#△ 59.8±1.9*#△

表4 4组Ec-9706细胞cyclin D1蛋白表达比较Table 4 Comparison of cyclin D1 protein expression of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=5，±s，OD）

表4 4组Ec-9706细胞cyclin D1蛋白表达比较Table 4 Comparison of cyclin D1 protein expression of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=5，±s，OD）

*P＜0.05 vs group C #P＜0.05 vs group L1△P＜0.05 vs group L2by q test

Groups 24h 48h 72h C 89.0±2.1 88.9±1.1 90.7±2.5 L1 87.2±1.7 82.6±1.4* 78.0±1.4*L2 80.5±1.7 75.1±1.5*# 69.2±1.3*#L3 70.9±1.3*#△ 64.7±1.2*#△ 59.6±1.1*#△

表5 4组Ec-9706细胞Fas蛋白表达比较Table 5 Com parison of Fas protein expression of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=5，±s，OD）

表5 4组Ec-9706细胞Fas蛋白表达比较Table 5 Com parison of Fas protein expression of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=5，±s，OD）

*P＜0.05 vs group C #P＜0.05 vs group L1△P＜0.05 vs group L2by q test

Groups 24h 48h 72h C 5.6±2.4 7.3±3.0 10.0±2.5 L1 18.6±2.3* 26.9±3.4* 39.2±2.9*L2 30.1±3.5*# 42.5±2.6*# 51.3±3.2*#L3 49.7±3.9*#△ 60.1±4.1*#△ 70.8±3.4*#△

表6 4组Ec-9706细胞Caspase-3蛋白表达比较Table 6 Com parison of Caspase-3 protein expression of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=5，±s，OD）

表6 4组Ec-9706细胞Caspase-3蛋白表达比较Table 6 Com parison of Caspase-3 protein expression of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=5，±s，OD）

*P＜0.05 vs group C #P＜0.05 vs group L1△P＜0.05 vs group L2by q test

Groups 24h 48h 72h 0 6.1±2.0 7.4±1.3 9.3±2.1 L1 18.9±2.7* 29.2±2.8* 43.1±2.3*L2 32.5±3.5*# 44.1±3.0*# 55.0±2.9*#L3 52.6±3.6*#△ 62.4±3.1*#△ 74.3±4.0*#△

3 讨 论

本实验研究了叶黄素对低分化人食管癌Ec-9706细胞株的增值抑制和凋亡诱导作用。肿瘤细胞区别于正常细胞的一个重要特征就是肿瘤细胞可以持续分裂并不断增殖［3］。本研究结果显示，叶黄素对Ec-9706细胞增殖有显著的抑制作用，并呈浓度依赖性，随着作用时间的延长160μmol/L浓度叶黄素组对 Ec-9706细胞的生长抑制作用大于40μmol/L浓度组，叶黄素溶液在160μmol/L浓度下作用72h对细胞的抑制增殖作用最明显。

PCNA又称周期蛋白，是DNA聚合酶8的辅助成分，与细胞的DNA复制有关［4］，与细胞周期的不同时相密切相关［5］。PCNA的阳性表达程度直接反映DNA复制的程度，可作为评价细胞增殖状态的重要指标［6］。本研究结果显示，在 Ec-9706细胞中PCNA阳性表达的平均光密度值为90.5±2.3，随着叶黄素浓度的增加和作用时间的延长，PCNA在Ec-9706细胞中的阳性表达率逐渐降低，160μmol/L叶黄素溶液作用72h后细胞中PCNA的阳性表达率平均光密度值仅为59.8±1.9。说明叶黄素可以抑制Ec-9706细胞的增殖。

cyclin D1是调节细胞周期的主要蛋白之一，其在细胞由G0期进入G1期的过程中起重要作用。若cyclin D1受抑制，则细胞不能进入S期，增殖受到抑制［7］。本研究结果显示，在Ec-9706细胞中cyclin

D1阳性表达的平均光密度值为89.0±2.1，随着叶黄素浓度的增加和作用时间的延长，cyclin D1在Ec-9706细胞中的阳性表达率逐渐降低，160μmol/L叶黄素溶液作用72h后细胞中cyclin D1的阳性表达率平均光密度值仅为59.6±1.1。此结果与流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况结果一致。说明叶黄素可以通过下调cyclin D1的表达抑制Ec-9706细胞的增殖，促进凋亡。

Fas属于神经生长因子/肿瘤坏死因子受体超家族成员，是一种促进凋亡的相关基因［8］。Fas途径是T细胞消灭肿瘤细胞的重要途径。肿瘤细胞下调Fas的表达水平使免疫逃避发生［9］。本研究结果显示，随着叶黄素浓度的增加和作用时间的延长，Fas在 Ec-9706细胞中的阳性表达率逐渐增高，160μmol/L叶黄素溶液作用72h后Fas在细胞中的阳性表达平均光密度值增高至70.8±3.4。提示叶黄素有可能作用于细胞中的Fas蛋白，使Fas信号传导体系诱导激活细胞中的细胞凋亡途径相关因子。说明叶黄素可以通过此途径诱导Ec-9706细胞的凋亡。

Caspase-3是天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶家族中最重要的一员，是细胞凋亡的关键效应分子。其活化可以导致级联反应活化，直接激活DNA断裂因子和核酸内切酶，降解细胞骨架蛋白，导致细胞凋亡［10］。本研究结果显示，随着叶黄素浓度的增加和作用时间的延长，Caspase-3在Ec-9706细胞中的阳性表达率逐渐增高，160μmol/L叶黄素溶液作用72h后Caspase-3在细胞中的阳性表达平均光密度值增高至74.3±4.0。与Fas表达水平结果一致。提示叶黄素可以通过此凋亡共同途径诱导Ec-9706细胞的凋亡。

肿瘤的生物学共性是失控性生长，主要机制是细胞周期紊乱导致增殖过多和凋亡过少。细胞凋亡是指由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序诱导的细胞死亡过程［11］。凋亡细胞的DNA分子发生断裂，相对分子质量小的DNA片段丢失，相对分子质量大的片段形成一个DNA含量小于二倍体的区域，在流式细胞仪检测中形成位于G0/G1峰之前的亚G1峰，坏死的细胞检测不出现此峰，故此峰被称作凋亡峰，凋亡峰的高度和宽度与凋亡细胞的数量成正比［12］。本研究结果显示，随着叶黄素作用浓度的增高和作用时间的延长，亚G1峰的高度和宽度随之增加。说明叶黄素可以诱导Ec-9706细胞凋亡，并有浓度依赖关系。此结果与前面噻唑兰和流式细胞仪分别检测细胞的增殖能力和细胞周期相一致。

综上所述，叶黄素可抑制体外培养的人食管癌Ec-9706细胞的增殖，诱导其凋亡，且呈浓度依赖性，其可能机制与抑制cyclin D1和PCNA的表达，同时活化Fas和Caspase-3有关。

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（本文编辑：赵丽洁）

EFFECTSOF LUTEIN ON THE PROLIFERATION AND APOPTOSIS OF HUMAN ESOPHAGEAL CARCINOMA EC-9706 CELLS IN VITRO

LILi1，REN Guangwei2，ZHAO Yu1，GONG Miao1，MENG Li1，GAO Fulu3*
（1.Department of Histology and Embryology，the School of Basic Medical Sciences，HebeiMedical University，Shijiazhuang 050017，China；2.Department of Nephrology，the First Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050031，China；3.School of Life Sciences，Hebei Normal University，Shijiazhuang 050024，China）

Objective To observe the effects of lutein on the proliferation and apoptosis of human esophageal carcinoma 9706（Ec-9706）cell line in vitro.M ethods The inhibitory effect of lutein on the proliferation of human Ec-9706 cells at different concentrations was determined by methyl thiazolyltetrazolium（MTT）assay.The changes of cell apoptosis rate of tumor cells were determined by flow cytometry（FCM）.The expression of Fas，proliferating cell nuclear antigen（PCNA），cyclin D1 and Caspase-3 proteins were examined by immunocytochemical technique.Results Lutein significantly inhibited the proliferation and induced the apoptosis of Ec-9706 cells in a dose-dependentmanner.Lutein dramatically inhibited protein expression of PCNA and cyclin D1，while up-regulated the expression of Fas and Caspase-3 protein.Conclusion Lutein can inhibit the proliferation of Ec-9706 cells and induce the apoptosis of Ec-9706 cells in vitro by down-regulating the expression of PCNA and cyclin D1 and up-

esophageal neoplasms；cell proliferation；apoptosis；lutein

R735.1

A

1007-3205（2013）03-0249-04

2012-12-11；

2013-02-26

河北省科技厅计划指导课题（10276181）

李莉（1976-），女，河北石家庄人，河北医科大学基础医学院讲师，医学硕士，从事组织胚胎学研究。

*通讯作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.03.001

regulating Fas and Caspase-3 expression.