高血压性脑出血患者血浆循环DNA与纤维蛋白原相关性研究

·论 著·

高血压性脑出血患者血浆循环DNA与纤维蛋白原相关性研究

赵召霞1，高 虹2，徐运强3，刘 蓓3，王荣霞3，潘世扬4

（1.河北省石家庄市第五医院检验科，河北石家庄050021；2.河北省石家庄市第四医院检验科，河北石家庄050011；3.河北省石家庄市第二医院检验科，河北石家庄050051；4.江苏省人民医院检验科，江苏南京210029）

目的探讨高血压性脑出血患者血浆循环DNA与纤维蛋白原的相关性。方法 采集30例高血压性脑出血患者发病后24h静脉血，采用双重荧光定量PCR技术检测血浆循环DNA水平，并同时检测血浆纤维蛋白原水平。采集30例健康体检者静脉血作为对照组。结果 脑出血患者血浆循环DNA水平（313.2±224.7）mg/L，显著高于对照组的（26.1±5.9）mg/L，差异有统计学意义（P＞0.05）。脑出血患者轻、中、重度3组血浆循环DNA水平之间差异有统计学意义（P＜0.05），重度组血浆循环DNA水平显著高于轻度组和中度组（P＜0.05），中度组显著高于轻度组（P＜0.05）。脑出血患者血浆纤维蛋白原水平（4.25±1.51）g/L，显著高于对照组的（2.76±0.85）g/L，差异有统计学意义（P＜0.05）；重度组血浆纤维蛋白原水平显著高于轻度组和中度组（P＜0.05）；中度组与轻度组间血浆纤维蛋白原水平差异无统计学意义。脑出血患者血浆循环DNA水平与其纤维蛋白原水平呈显著正相关（r=0.632，P＜0.05）。结论 血浆循环DNA可作为反映高血压性脑出血后脑组织细胞损伤及严重程度的灵敏指标。

颅内出血，高血压性；纤维蛋白原；诊断

循环DNA（circulating DNA）是存在于血液（血浆或血清）、滑膜液、脑脊液等体液中的细胞外DNA，目前国外文献报道血浆中循环DNA水平的高低与创伤和感染的严重程度相关，高水平循环DNA预示着临床的高病死率。高血压性脑出血发病率高，预后差，虽然一些临床评分可预测脑出血的预后，但仍缺乏可靠的实验室指标指导临床医生作出正确判断。本研究检测高血压性脑出血患者早期血浆循环DNA和纤维蛋白原水平，旨在探讨其在脑出血患者中的相关性以及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选取2010年10月—2011年5月在河北省石家庄市第二医院住院的高血压性脑出血患者30例，诊断符合中华医学会第4次全国脑血管病会议制定的诊断标准［1］，其中男性20例，女性10例，年龄41～64岁，平均（50.9±9.2）岁。所有患者经头颅 CT检查证实有颅内出血，出血量10～120mL，平均（45.6±23.8）mL。病情轻重参照脑卒中患者临床神经功能缺损程度评分标准进行评估，其中轻度9例，中度13例，重度8例。所有患者排除发病前并发急慢性感染、肿瘤、免疫性疾病等。选择同期健康体检者30例作为对照组，其中男性19例，女性11例，年龄40～60岁，平均（49.3±1.9）岁。2组性别、年龄差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 血浆标本的采集和保存：采集健康体检者和高血压性脑出血患者发病24h内静脉血2mL，乙二胺四乙酸抗凝，3 000r/min离心10min，吸取上清于1.5mL离心管中，16 000 r/min离心10min，吸取上层无细胞血浆200μL，置于含有5.0×104拷贝重组质粒0.2mL离心管（江苏省人民医院潘世扬教授馈赠）中，充分混匀后，-20℃保存备用。

1.2.2 血浆循环DNA的提取：采用磁珠法同步提取血浆DNA和重组质粒，试剂盒由上海浩源生物有限技术公司提供。

1.2.3 荧光定量PCR检测血浆循环DNA：采用双重荧光定量PCR技术检测提取的血浆DNA和重组质粒，检测方法参见文献［2］。试剂盒由江苏省人民医院潘世扬教授馈赠。

1.2.4 血浆纤维蛋白原的检测：抽取外周血2mL，加入1∶9枸橼酸钠抗凝试管中混匀，3 000 r/min离心10min，分离出血浆，用日本Sysmex CA1500型血凝仪测定血浆纤维蛋白原水平。

1.3 统计学方法：应用SPSS13.0统计学软件包进行数据处理。计量资料以±s表示，分别采用单因素方差分析、q检验及t检验；相关性采用Pearson直线相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血浆循环DNA水平比较：高血压性脑出血患者血浆循环DNA水平显著高于对照组差异有统计学意义（P＜0.05）。脑出血患者轻、中、重度3组血浆循环 DNA水平之间差异有统计学意义（F= 19.362，P＜0.05）。脑出血患者重度组血浆循环DNA水平显著高于轻度组和中度组，中度组显著高于轻度组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 血浆纤维蛋白原水平变化：高血压性脑出血患者血浆纤维蛋白原水平显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。高血压性脑出血患者重度组血浆纤维蛋白原水平显著高于轻度组和中度组，差异有统计学意义（P＜0.05）；中度组与轻度组间血浆纤维蛋白原水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

Groups n Circulating DNA（mg/L）Fibrinogen（g/L）Control 30 26.1±5.9 2.76±0.85 Intracerebral hemorrhage 30 313.2±224.7* 4.25±1.51*Mild 9 73.4±20.8 2.89±1.23 Moderate 13 264.4±88.7# 3.21±1.36 Severe 8 546.2±152.9#△ 5.29±2.31#△

2.4 血浆循环DNA水平与纤维蛋白原水平相关性分析：高血压性脑出血患者血浆循环DNA水平与其纤维蛋白原水平呈显著正相关（r=0.632，P＜0.05）。

3 讨 论

现代社会脑卒中发病率、致残率均较高，严重威胁着中老年人的健康。高血压性脑出血病理生理机制复杂，脑出血后引起机体及脑组织局部一系列病理生理反应。脑出血后，除血肿本身的占位性损害外，血肿对周围脑组织的直接破坏和继发性脑损伤是影响预后的重要因素。脑出血后血凝块释放大量凝血酶，后者与表达在脑组织神经元、神经胶质细胞以及内皮细胞上的凝血酶受体结合，通过一系列信号转导，导致细胞膜功能或结构的破坏，最终不但可通过细胞毒作用直接损害神经细胞，导致细胞凋亡，还能破坏血脑屏障，形成脑水肿［3］。细胞凋亡、脑水肿和DNA损伤均能导致细胞核内核酸释放致外周血中。循环DNA是一种无细胞状态的细胞外DNA，健康人和许多疾病患者血清和血浆中都含有一定量的循环DNA。关于血浆循环DNA的来源目前研究倾向2种观点：一是细胞主动分泌或释放产生的DNA片段，这种情况主要发生在肿瘤细胞，肿瘤患者血浆循环DNA水平显著升高，其来源大多数是肿瘤细胞分泌释放［4］；二是细胞死亡后释放的DNA片段，当机体伴有大量组织细胞破坏时，其胞内核酸释放，外周血循环DNA的含量会急剧上升。本研究结果显示高血压性脑出血患者血浆循环DNA水平显著升高，说明高血压性脑出血后原发或继发的脑组织损伤，导致脑组织细胞破坏，DNA释放至血中，致循环DNA的水平升高，因此循环DNA可作为反映高血压性脑出血后脑组织细胞损伤程度的一项指标。

纤维蛋白原是体内凝血系统的凝血因子，具有参与炎症反应、血小板活化和血栓形成的病理生理功能，研究发现血浆纤维蛋白原是脑卒中有力的预测因子［5-6］，急性缺血性脑血管病早期血浆纤维蛋白原增高提示预后不良［7-8］。本研究结果显示脑出血患者血浆纤维蛋白原水平显著高于对照组（P＜0.05），这一结果也与杨松斌等［9］研究结果一致。高血压性脑出血患者血浆纤维蛋白原浓度的升高提示预后不良，本研究结果还显示高血压性脑出血患者血浆循环DNA水平与其纤维蛋白原水平呈显著正相关，提示检测循环DNA对判断高血压性脑出血病情严重程度和预后具有重要临床意义。高血压性脑出血患者重度组血浆循环DNA水平显著高于轻度组和中度组（P＜0.5）；并且中度组显著高于轻度组（P＜0.5）。虽然脑出血患者重度组血浆纤维蛋白原水平显著高于轻度组和中度组（P＜0.5），但是中度组与轻度组间血浆纤维蛋白原水平差异无统计学意义。因此，血浆循环DNA水平更能准确、灵敏地反映高血压性脑出血患者的病情严重程度。

［1］中华医学会神经科分会.各类脑血管疾病诊断要点［J］.中华神经科杂志，1996，29（6）：379.

［2］陈丹，潘世扬，张丽霞，等.人血浆DNA双重实时荧光定量PCR检测法的建立［J］.临床检验杂志，2007，25（3）：177-179.

［3］邓平，吴晓牧.高血压脑出血病理生理机制研究进展［J］.中华脑血管病杂志：电子版，2010，4（4）：267-278.

［4］屠红，高海峰，傅士龙，等.肿瘤患者循环DNA的定量研究［J］.中华肿瘤杂志，2204，26（10）：606-608.

［5］李敏，董万利.进展性卒中危险因素的临床分析［J］.中国脑血管病杂志，2010，7（4）：187-190.

［6］CAMPBELL RA，ALEMAN M，GRAY LD，et al.Flow profoundly influences fibrin network structure： implications for fibrin formation and clot stability in haemostasis［J］.Thromb Haemost，2010，104（6）：1281-1284.

［7］陈勇，陈道文，陈晨，等.检测脑卒中患者纤维蛋白原及血小板参数变化的临床意义［J］.国际检验医学杂志，2011，32（19）：2210-2212.

［8］张国芬.脑卒中患者伴焦虑和抑郁障碍104例临床分析［J］.河北医科大学学报，2010，31（12）：1503-1504.

［9］杨松斌，董晓巧，胡悦育.血浆D-二聚体、C反应蛋白和纤维蛋白原与脑出血预后的相关研究［J］.浙江医学，2010，32（4）：461-463.

（本文编辑：刘斯静）

THE RELATIONSHIP BETWEEN PERIPHERAL BLOOD CIRCULAR DNA AND FIBRINOGEN IN PATIENTSW ITH HYPERTENSIVE INTRACEREBRAL HEMORRHAGE

ZHAO Zhaoxia1，GAO Hong2，XU Yunqiang3，LIU Bei3，WANG Rongxia3，PAN Shiyang4
（1.Department of Laboratory Medicine，the Fifth Hospital of Shijiazhuang，Hebei Province，Shijiazhuang 050021，China；2.Department of Laboratory Medicine，the Fourth Hospital of Shijiazhuang，Hebei Province，Shijiazhuang 050011，China；3.Department of Laboratory Medicine，the Second Hospital of Shijiazhuang，Hebei Province，Shijiazhuang 050051，China；4.Department of Laboratory Medicine，the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Jiangsu Province，Nanjing 210029，China）

Objective To explore the relationship between peripheral blood circular DNA and fibrinogen in patientswith hypertensive intracerebral hemorrhage.M ethods Venous blood of 30 healthy people and 30 patients with hypertensive intracerebral hemorrhage within 24h of illness onset was collected.The level of plasma circular DNA was detected by duplex real-time polymerase chain reaction assay.The level of fibrinogen was detected by blood coagulation analyzer.Results The level of circular DNA in patientswith intracerebral hemorrhage（313.2±224.7）mg/L was significantly higher than that in control group（26.1±5.9）mg/L（P＜0.05）.Patientswith intracerebral hemorrhagewere divided into mild，moderate and severe group.The levels of plasma circular DNA among the three groups were significantly different（P＜0.05）.The level of plasma circular DNA in severe group was significantly

intracranial hemorrahage，hypertensive；fibrinogen；diagnosis

R743.34

A

1007-3205（2013）03-0253-03

2012-04-26；

2012-07-11

石家庄市科学研究与发展计划课题（101461293）；江苏省实验诊断学重点实验室重大课题（XK200731）

赵召霞（1978-），女，山西平陆人，河北省石家庄市第五医院医师，医学硕士，从事分子生物学研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.03.002

higher than that in mild and moderate group（P＜0.05）；moderate group significantly higher than the mild group（P＜0.05）.The level of fibrinogen in patientswith intracerebral hemorrhage（4.25±1.51）g/L was significantly higher than control group（2.76±0.85）g/L（P＜0.05）.The level of fibrinogen in severe group was significantly higher than that in mild and moderate group（P＜0.05），but the levels of fibrinogen inmoderate group and mild group had no significant difference.Therewas significantly positive correlation between the level of circular DNA and that of fibrinogen（r=0.632，P＜0.05）.Conclusion

Plasma circular DNA can be used as a sensitive parameter of brain cell damage and severity after intracerebral hemorrhage.