两种中药复方对脑缺血再灌注大鼠脑组织Glu含量及NMDA受体亚单位NR1表达的影响

王业梅 胡建鹏 程惠娟

安徽中医药大学，安徽 合肥 230038

两种中药复方对脑缺血再灌注大鼠脑组织Glu含量及NMDA受体亚单位NR1表达的影响

王业梅 胡建鹏 程惠娟

安徽中医药大学，安徽 合肥 230038

目的：比较益气活血汤、镇肝熄风汤和星蒌承气汤3种中药复方对急性脑缺血再灌注大鼠缺血脑组织Glu含量与NR1表达的影响。方法：采用线栓法阻断大鼠左侧大脑中动脉制作局灶性脑缺血再灌注模型。大鼠随机分为假手术组、模型组、镇肝熄风汤和星蒌承气汤组。采用高效液相色谱法和免疫组化SABC染色法，分别检测Glu的含量和NR1表达。结果：脑缺血2h再灌注各时间点与假手术组比较，模型组Glu含量和NR1表达均显著升高和增加（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，各治疗组各时间点Glu含量和NR1表达显著降低和减少（P＜0.01）；治疗组组间比较，48h无显著差异，6h星蒌承气汤组在减少NR1表达方面最优（P＜0.05）；结论：两种中药复方可以通过降低Glu含量和减少NR1表达，减轻兴奋性氨基酸毒性，抗脑缺血再灌注损伤。

脑缺血再灌注；镇肝熄风汤；星蒌承气汤；谷氨酸；N－甲基－D－天冬氨酸受体

脑卒中在现代医学中又称脑血管疾病或脑血管意外，为高发病率、死亡率、致残率和复发率疾病，是危害人类健康的重大疾病之一，死亡率高于心血管疾病及癌症［1］，其中，缺血性脑卒中最为多见，故研究其治疗药物具有重要临床价值。脑缺血缺氧后，神经元释放大量以谷氨酸（glutamate，Glu）为代表的兴奋性氨基酸（excitatory amino acids，EAA）通过激活其N－甲基－D－天冬氨酸（N－methyl－D－aspartate，NMDA）受体（NR1是其主要功能亚单位）而引起神经元的缺血缺氧性损伤［2］。潜阳熄风、化痰通腑为缺血性中风急性期临床常见治法［1］。本实验通过观察上述两种治法的代表中药方剂对脑缺血再灌注大鼠缺血脑组织Glu含量及NR1表达的影响，以探讨其抗脑缺血再灌注损伤的作用机制，为两种中医治法的临床合理应用提供实验依据，丰富与发展中医脑病理论。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 健康Wistar雄性大鼠96只，体质量280 ±20g，由安徽医科大学实验动物中心提供 （合格证号：SCXK－5100104）。将动物随机分为假手术组、模型组、镇肝熄风汤和星蒌承气汤4组。每组24只，分缺血2h后再灌注6h、48h、72h三个不同时间点，每个时间点各8只（其中4只用于Glu含量的检测，4只用于NR1表达的检测）。

1.2 药物与试剂 镇肝熄风汤组：选用镇肝熄风汤，由怀牛膝30g、生代赭石30g、生牡蛎15g等组成。星蒌承气汤组：选用星蒌承气汤，由全栝蒌30g、胆南星10g、生大黄10g等组成。全部药物由安徽中医学院中药制剂中心制备，相当于原生药6.0g/mL，NR1单克隆抗体、二抗试剂盒、DAB、APES由北京博奥森生物技术有限公司提供。

1.3 局灶性脑缺血再灌注模型的制备 参考Longa［3］大脑中动脉阻塞 （MCAO）改良制作局灶性脑缺血再灌注动物模型。

1.4 给药方法与标本采集造模成功的大鼠按组分别给药，镇肝熄风汤20.3g/kg、星蒌承气汤7g/kg的剂量每日上午及下午各给药1次。假手术组、模型组按同样方法予以等量生理盐水灌胃。在再灌注各个相应的时间点麻醉动物（0.36ml/100g体重），一部分快速断头取脑，液氮保存，而后置于－700C超低温冰箱，用于Glu含量的检测；另一部分迅速开胸暴露心脏，于右心耳部剪一小口，从左心室

插入导管至主动脉，用200ml肝素化生理盐水快速冲洗，至右心房流出液变清亮，随后用4%多聚甲醛磷酸缓冲液（4oC，PH7.4）灌注约30min，灌注后立即取脑，放入4%多聚甲醛磷酸缓冲液中保存，用于检测的NR1表达。

1.5 指标检测方法 自视交叉后切取缺血侧额顶叶皮质200mg，称重，加4%的磺基水杨酸8ml研磨。10000r/min离心机离心10min，离心后吸取上清液应用高效液相法测Glu含量。NR1检测采用免疫组化SABC染色法，采用Nikon ECLIPSE E600全自动图像分析系统，在相同的视野下，分别对相邻切片的NR1免疫反应阳性细胞数进行分析。

1.6 统计学方法 数据均用“X±s”表示，组间比较采用t检验，所有统计由SPSS 11.0软件处理。

2 结果

2.1 两种中药复方对脑缺血再灌注大鼠不同时间脑组织Glu含量的影响（表1）

与假手术组比较，缺血再灌注6h、48h、72h，模型组Glu含量显著升高（P＜0.01）；各治疗组与同时段的模型组比较均有显著降低（P＜0.05）；2用药组组间比较无明显差异（P＞0.05）。

表1 各组大鼠脑缺血再灌注不同时间Glu含量的比较（±s）

表1 各组大鼠脑缺血再灌注不同时间Glu含量的比较（±s）

与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05；

9 4.54±1.31 3.84±1.11 4.24±1.25模型组 9 6.92±1.39**5.87±1.20**5.66±1.09**镇肝熄风汤 9 5.55±1.34△3.98±1.38△ 4.88±1.27△星蒌承气汤 9 4.64±1.29△4.70±1.19△ 4.90±1.17 n 6 h 48h 72h假手术组组别△

2.2 两种中药复方对脑缺血再灌注大鼠不同时间NR1表达的影响（表2，图1）

与假手术组比较，缺血再灌注6h、48h、72h，模型组NR1阳性细胞数显著升高（P＜0.01）；各治疗组与同时段的模型组比较均有显著降低（P＜0.05）；2用药组组间比较，缺血再灌注6h，星蒌承气汤最优（P＜0.05）；

表2 各组大鼠脑缺血再灌注不同时间NR1阳性细胞数的比较（±s）

表2 各组大鼠脑缺血再灌注不同时间NR1阳性细胞数的比较（±s）

与假手术组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05；与镇肝熄风汤组比较▲P＜0.05；

6 55.13±21.92 60.30±24.45 58.36±21.60模型组 6 126.30±17.60*155.21±43.79*115.21±29.32*镇肝熄风汤 6 91.37±33.01△81.37±25.01△82.69±42.37△星蒌承气汤 6 66.86±21.36△▲72.86±17.47△71.26±34.30 n 6 h 48h 72h假手术组组别△

3 讨论

大量实验表明，兴奋性毒性是造成缺血再灌注后脑损伤的主要原因之一［4］。兴奋性氨基酸是主要包括Glu、天门氨酸（aspartate，Asp）等，EAA在脑内的含量极高，尤其是Glu。兴奋性氨基酸受体分为代谢型受体和离子型受体，NMDA受体属于离子型受体的一类。NR属于NMDA受体家族，其中NR1是该受体的主要功能单位，它在中枢神经系统内广泛分布。研究表明NR在多种神经兴奋毒性过程中起关键作用［5］，脑缺血再灌注引起的神经元死亡主要是由Glu大量释放作用其NMDA受体 （主要是NR1）引起的兴奋毒性作用所致［6－7］。王英等［8］研究表明脑缺血后NMDA受体表达对EAA的释放起正性调节作用，即缺血后Glu释放激活NMDA受体表达，而NMDA受体表达的增加又促使Glu释放，在脑缺血再灌注12h、24h、48h后均显示了这一特点。李净等［9］研究表明脑缺血2h再灌注6h NMDA受体蛋白表达就增加，至72h逐渐降低。我们的研究结果与报道的有所差别，但基本一致。

缺血性中风因其临床病证表现复杂多样，临床上出现了很多不同的理法方药。近年来出现很多治疗方法如解毒通络法、补肾活血、化痰祛瘀、利水通降法等，虽取得了一定治疗效果，并在一定层次上阐明了方药的作用机制，但依然有局限性［10－11］。镇肝息风、化痰通腑法是临床治疗缺血性中风的常见治法，故我们的实验选用这两种方法。我们的研究表明，模型组缺血脑组织中Glu的含量和NR1表达显著高于假手术组，说明Glu的兴奋性毒性作用参与了脑缺血的病理生理过程。治疗组与模型组比较，不同时间位点缺血脑组织中Glu含量和NR1表达显著降低，提示脑缺血后应用两种中药复方在不同的时间位点均可降低或减少缺血脑组织中Glu的含量和NR1表达，发挥脑保护作用。治疗组组间比较6h以星蒌承气汤组为佳，而其他时间点则无明显差别。这说明了两种中药复方可能存在着不同的作用时期及作用途径。其原因是脑缺血后兴奋性毒性引起的损伤级联反应的复杂性，是多环节多因素参与的结果，两种中药复方可能作用于级联反应不同的一个或多个环节或因素；另外，两种中药复方成分不同，其作用时期及作用途径必然不同，确切的机制有待进一步研究。

［1］张文立，黄文奎.中风急性期通腑化痰法证治探讨.中医药学刊，2005，23（7）：1244.

［2］Lipton P.Ischemic cell death in brain neurons［J］.Physiol Rev，1999，79（4）：1431－1568.

［3］Longa EZ，weinstein PR，Carlson，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke，1989；20（1）：84－91.

［4］Lipton P.Ischemic cell death in brain neurons［J］.Physiol Rev，

1999，79（4）：1431－1568.

［5］Planells－Cases R，Lerma J，Ferrer－MontielA.Pharmaco－logical intervention at ionotropic glutamate receptor comple－xes［J］.CurrPharm Des，2007，12：358.

［6］赵刚，李树清.兴奋性氨基酸毒性与缺血性脑损伤 ［J］.国外医学脑血管病分册，2004，12（3）：426－429.

［7］Zipfel GJ，Babcock DJ，Lee JM，et al.Neuronal apoptosis after CNS injury：the roles of glutamate and calcium［J］.JNeuro－trauma，2000，17（10）：857－869.

［8］王英，张云丽.谷氨酸受体对脑缺血再灌注模型大鼠脑组织兴奋性氨基酸的调节作用.中华神经科杂志，2009，42：125－127.

［9］李净，李小亮，胡建鹏.脑络欣通对脑缺血再灌大鼠神经细胞凋亡率及NMDAR蛋白表达的影响.安徽中医学院学报，2008，27（10），29－31.

［10］李净，王键，韩小祥.脑络欣通对脑缺血再灌注模型大鼠海马CA1区神经细胞凋亡的动态影响.中国中医药科技，2006，13（4）：222.

［11］Osuka K，Feustel PJ，Mongin AA，et al.Tamoxifen inhibits nitricty－rosine formation after reversible middle cerebral artery occlusion in the rat［J］.JNeurochem，2008，76（6）：1842－1850.

Comparative Study on Effects of Two Traditional Chinese Medicinal Compounds on Content of Glutamate and Expressions of NR1 in Cerebral Tissue of Rats after Focal Cerebral Ischemia and Reperfusion

WANG ye－mei，HU jian－peng，CHENG huijuan
Anhui College of Traditional Chinese Medicine，Hefei，230038

Objective：To compare the effects of two traditional Chinese medicinal compounds on content of glutamate and expressions of NR1 in cerebral tissue of rats after focal cerebral ischemia and reperfusion（I/R）.Methods：The local cerebral I/Rmodel was established by ligation of the middle cerebral arteries（MCA）.The animals were divided into the sham－operative group，the model group，the Zhengan Xifeng Decoction（ZXD）group and the Xinglou Chengqi Decoction（XCD）group.The contents of glutamate was detected by HPLC.Im－munohistochemical SABC method was used to obsevre the expressions of NR1.Relusts：Compared with those of the sham－operative group，the contents of glutamate and expressions of NR1 increased markedly at all time pionts after I/R in model group.Compared with those of model group，the contents of glutamate and expressions of NR1 decreased or reduced at all time pionts after I/R in all treatment groups.The optimal effects were shown in XCD at6 h in reducing expressions of NR1.Conclusion：The two traditional Chinese medicinal compounds could reduce pathologic injury after focal cerebral I/R by decreasing or reducing contents of glutamate and expressions of NR1.

cerebral ischemia and reperfusion；Zhengan Xifeng Decoction；Xinglou Chengqi Decoction；glutamate；N－methyl－D－aspartate receptor

285.5

A

1007－8517（2013）12－0033－02

2013.4.6）

国家自然科学基金面上项目（81173629）；安徽省自然科学基金课题（1208085QH150）

王业梅（1977－），女，讲师，研究方向：中西医结合基础研究Tel：（0551）5169206