非对称性二甲基精氨酸在慢性心力衰竭发病过程中的作用机制研究*

黄俊喜，邹文姝，曾火才，曾 燕，曾林源

(广东省河源市和平康平医院急诊科，广东 河源 517200)

80%心血管疾病的终末阶段都会出现慢性心力衰竭症状［1］，主要表现为肺循环和体循环出现淤血特征。对慢性心力衰竭病症的诊断难度较大，主要是针对轻、中度慢性心力衰竭患者的初期诊断及治疗策略设定能够显著改善患者的预后。慢性心力衰竭(CHF)发病与神经激素异常激活、炎性细胞因子如TNF－α等有紧密的关系［2］。尽管如此，近来研究发现，在慢性心力衰竭(CHF)患者血清中非对称性二甲基精氨酸能够抑制一氧化氮合酶的生成［3］，进而影响一氧化氮(NO)的生成，而且从基因水平也得到了一致性结果，这一机制可能是慢性心力衰竭发病的一个产生原因，本研究探讨血清非对称性二甲基精氨酸浓度在慢性心力衰竭患者发病过程中的作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料:随机选择2008年2月至2010年12月在我院住院慢性心力衰竭患者70例，男37例，女33例，年龄55－65岁，平均(60.23±2.13)岁，于入院当天进行超声心动图检查，并记录左室舒张末期内径(LVEDD)和左室射血分数(LVEF)按纽约心脏学会(NYHA)标准心功能分级为Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级，其中Ⅱ级22例，Ⅲ级25例，Ⅳ级23例。所有研究对象均排除急慢性感染、肝肾功能不全、严重的电解质紊乱、自身免疫性疾病、糖尿病、恶性肿瘤、应用类固醇治疗者和半年内有过急性心肌梗死者。另外，选择同时期经过体检健康者70例，男36例，女34例，年龄55－65岁，平均(60.45±2.37)岁。两组比较差异具有可比性，无统计学意义。

1.2 方 法

1.2.1 检测指标及方法:两组受试者入院后空腹10－13h，在仰卧姿势条件，静息状态下抽取2mL肘静脉血［9］，采用抗凝管装存，血浆分离后－70℃保存，采用ELISA法在酶标仪上测定血清非对称性二甲基精氨酸的含量。采用硝酸还原酶比色法(南京建成生物工程研究所检测血清中NO的含量。采用彩色多普勒超声诊断仪(美国ACUSIONl28 XWIO型)变频探头2.0－3.5MHz。左心室参数测定包括舒张末内径(LVEDD)、左心室射血分数(LVEF)。

1.2.2 RNA 提取:1000rpm/min离心细胞收取，转至1.7mL离心管，加入 1mL Trizol溶液，加入 0.2mL氯仿。Vortex混匀，5min室温静置，然后11000rmp离心，时间为15min。将上层的水相转入到1.5mL EP管，添加等体积异丙醇，Vortex混匀，然后置于－20℃冰箱中，过30min后，11000rmp离心10min。小心把上清倒掉，保留沉淀。添加1mL 75%的乙醇，然后洗涤RNA沉淀，最后7000rmp离心6min。弃上清，静置5min。

1.2.3 RT－PCR:NanoDrop定量后按照 TOYOBO 的RT－PCR试剂盒说明书进行。反转录反应条件:37℃25min(RT－PCR反应)85℃ 5sec(酶失活反应)。

1.2.4 实时荧光定量Q－PCR:用 Primer Premier 5.0的软件设计、并合成了相关基因引物，上海博尚生物技术有限公司合成引物，其特异性利用融解曲线进行分析验证。cDNA表达丰度采用Ct值进行检测，β－actin的Ct值作为内参。反转录结束之后，利用SYBR Green(Toyobo)按说明书进行荧光定量PCR。三步法进行Q－PCR扩增反应条件如下:

95℃10sec 1 cycle

95℃15sec

60℃20sec 45 Cycles

72℃35sec

Dissociation stage

1.3 统计学处理:采用SPSS 12.0软件进行统计分析，计量资料以±s表示，多组间数据采用方差分析。

2 结果

表1 各组血清非对称性二甲基精氨酸水平(pg/mL)及左心室超声心动图各参数比较

2.1 不同组间血清非对称性二甲基精氨酸水平及左 心室参数比较:不同心功能级别的慢性心力衰竭患者相比于对照组血清非对称性二甲基精氨酸水平比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。其中，ADMA随着心功能级别的升高，含量也随之增加。LVEDD没有规律性变化趋势，但是LVEF在患病组要低于对照组，同时与心功能级别呈负相关，见表1。

2.2 不同组间血清NO及NOS的含量比较:不同心功能级别的慢性心力衰竭患者相比于对照组血清NO及NOS水平比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。其中，NO及NOS在对照组中的含量高于患病组，而且在患病组中与心功能级别呈负相关。

表2 各组血清NO(pg/mL)及NOS的含量比较

2.3 不同心功能级别DDAH及NOS基因的表达水平:DDAH能够分解代谢机体内五分之四的非对称性二甲基精氨酸(ADMA)，使其排出体外，而NOS负责催化L－精氨酸生成NO。这两个基因在慢性心力衰竭发病中或许起到了关键性的作用。我们通过荧光定量PCR检测了DDAH－1，DDAH－2，NOS基因在对照组及患病组中的表达水平。结果发现，DDAH－2在不同组间无明显变化，但是DDAH－1及NOS的基因表达水平的患病组高于低于对照组，同时其表达水平与心功能级别呈负相关。(如图1)。

图1 不同心功能级别DDAH及NOS基因的表达水平

3 讨论

Vallance和他的研究团队在1992年报道ADMA是一氧化氮合酶的天然抑制剂［4］。ADMA能够抑制NO的产生，进而导致内皮功能紊乱及心血管疾病。动脉粥样硬化，慢性心力衰竭等疾病在研究领域的广泛关注也逐渐揭开了血清ADMA这一心血管风险因子的面纱。

从病理角度分析，慢性心力衰竭患者血清中ADMA水平逐渐升高。首先，ADMA能够通过抑制NO产生进行加剧慢性心力衰竭症患病，具体来说，NO的含量下降能够导致内皮功能紊乱［5］，而内皮功能紊乱与慢性心力衰竭紧密相关，这一紊乱状态无法被机体保护性分子如神经激素类因子所改善。其次，ADMA的初期体内累积能够抑制二甲基精氨酸的活性［6］，二甲基精氨酸是ADMA的主要降解途径。而二甲基精氨酸的活性受抑制机理是由于高度的氧化造成的，而且慢性心力衰竭的症状加剧也与过度氧化离不开［7］。

近来研究显示，血液中高浓度的ADMA被发现与慢性心力衰竭病症有紧密联系。这一发现也提示我们是否ADMA能够作为慢性心力衰竭的诊断指标。也有研究显示，ADMA伴随慢性心力衰竭的高浓度特征可能是由于代偿性机能减退的原因。为了解决这一难题，我们试图从分子水平进行研究，选择了DDAH基因，DDAH负责分解代谢机体内五分之四的ADMA［8］，解除其对一氧化氮合酶的抑制作用，DDAH有两个亚型，DDAH－1和DDAH－2，经过荧光定量PCR检测健康对照组和患病组中的DDAH基因表达水平，结果显示，尽管DDAH－2基因表达水平基本没有变化，但DDAH－2有显著的下调趋势。同时NOS也与其趋势相一致。

［1］ 胡春松，魏云峰.心力衰竭患者血清CA125，CA199水平变化及意义［J］.中国分子心脏病学杂志，2005，5(1):415－517.

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［4］ 陈倩，李小鹰，李江源.老年男性心力衰竭患者性激素水平调查及与同龄健康男性的比较［J］.中华心血管病杂志，2005，33:505－508.

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