响应面法优化可得然胶发酵培养基

袁 方，赵双枝，苏 理，张彦昊，郭宏明

（1.齐鲁工业大学食品与生物工程学院，山东济南250353；2.山东省食品发酵工业研究设计院，山东济南250013；3.山东省食品发酵工程重点实验室，山东济南250013；4.泰兴市一鸣生物制品有限公司，江苏泰兴225433）

微生物多糖是微生物在代谢过程中天然合成的聚合物[1]，具有安全、无毒等优良的理化性质及其他方面的特性。因此，在生物多糖领域中微生物多糖是近数十年来的研究热点[2]。

可得然胶（curd lan）最初是由日本大阪大学的原田教授[3]通过一株名为A lcalingenes faecalis Var—mgxgenes 10C3的细菌发酵得到的细胞外多糖。1996年美国FDA批准并允许可得然胶作为一种直接的添加剂用于食品行业[4]。我国从1999年开始把可得然胶作为食品添加剂开发的重点[5]，2006年，我国批准可得然胶作为新型的食品添加剂。

提高产量是发酵生产的关键，培养基配方对可得然胶产量影响较大，因此培养基优化工作非常必要[6]。国内对可得然胶培养基优化方面的研究报道较少。李卫旗等[7]通过对可得然胶产生菌株的诱变，获得1株遗传性状稳定，可得然胶产量为29.1g/L的菌株。詹晓北等[8]通过研究发现，培养基中NH4Cl浓度提高到3.6g/L时，可得然胶的产量可达30.5g/L。近几年来，对可得然胶的研究主要集中于应用方面，对基础发酵方面的研究报道较少。本文主要从提高多糖产量的角度出发，通过对可得然胶发酵培养基的优化，以期获得更高的得率。

由于发酵培养基是由多成分组成，且各成分之间可能相互影响[9]，因此单靠单因素和正交实验很难快速得到较好较严密的结果。本研究将PB筛选和响应面分析联合应用于可得然胶发酵培养基的优化，即采用PB设计方法考察6个实验因素，通过统计学筛选出4个关键因素，进一步利用Box-Behnken中心组合设计对这4个关键因素进行响应面优化分析，再通过实验验证，获得最佳发酵培养基配方。从而使可得然胶的产量得到较大幅度的提高，降低了生产成本，提高了工作效率，为可得然胶的工业化大生产奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌种 山东省食品发酵工业研究设计院保藏的一株粪产碱杆菌（A lcaligenes faecalis）；蔗糖 分析纯，天津广成化学试剂厂；蛋白胨、牛肉膏、琼脂 均为生物试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司；氯化钠 分析纯，天津福晨化学试剂厂；磷酸二氢钾、硫酸镁、磷酸氢二铵 均为分析纯，天津市巴斯夫化工有限公司；玉米浆 试剂级，山东寿光巨能金玉米公司；碳酸钙 分析纯，天津市致远化学试剂有限公司；95%乙醇 食品级，山东众信集团酒精分公司。

3924托盘天平 北京大栅栏天平厂；YXQ02手提式压力蒸汽灭菌锅 山东安得医疗科技有限公司；YX600W卧式压力蒸汽灭菌锅 上海三申医疗器械有限公司；TDL-5-A离心机 上海安亭科学仪器厂；SW-59-278洁净工作台 廊坊鹏彩精细化工有限公司；GNP-9080隔水式恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司；PHS-25 pH计 上海大普仪器有限公司；HZQ-Y振荡培养箱 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的配制 斜面培养基：蔗糖10g/L，牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，玉米浆1.5m L/L，琼脂15g/L，调节pH至7.0。

种子培养基：蔗糖20g/L，（NH）42HPO45g/L，KH2PO41.5g/L，MgSO41g/L，玉米浆1.5m L/L，CaCO33g/L，调节pH至7.2。

基础发酵培养基：蔗糖40g/L，（NH4）2HPO41.6g/L，KH2PO41.4g/L，MgSO40.7g/L，玉米浆1.7m L/L，CaCO31.4g/L，调节pH至7.0。

1.2.2 斜面菌种制备 将保存的菌种用划线的方法接种到新鲜的斜面培养基上，放置于恒温培养箱中，30℃培养3d。

1.2.3 种子培养 取一环活化好的斜面菌种，接入到装有80m L种子培养基的500m L三角瓶中，30℃，200r/min，摇床培养24h，即为种子液。

1.2.4 发酵培养 按5%的接种量，将种子液接入到装有80m L发酵培养基的500m L三角瓶中，30℃，200r/m in，摇床培养5d。

1.2.5 可得然胶得率测定方法 发酵液于离心机中5000r/m in离心20m in，移出上清液，沉淀中加入2倍体积的95%乙醇，充分混合，使多糖凝聚沉淀，3000r/m in离心5m in，对沉淀用95%乙醇清洗一次，烘干后称重。

1.2.6 可得然胶得率的计算 取100m L发酵液，根据1.2.5得率测定方法，进行得率计算。公式如下：

式中：N—得率，g/L；W—所取发酵液中多糖干重，g；V—所取发酵液体积，L。

人口密度是商业综合体选址的重要因素，人口密度丰富程度影响着商圈的商业发展。徐州的老城片区人口流量大，主要以传统的商业为主，一些本土超市、国营传统百货、百货大楼、古彭大厦等都选址在老城片区，是早期的商业中心。由于人口流量可以拉动消费，带动商业综合体的运营，商业综合体的选址多选择在居民点密集、高校周边、交通便利的地方。

1.3 实验设计

1.3.1 P-B实验设计 参考他人研究结果[10-11]及本实验室前期研究结果[12-13]，选用N=12的Plackett-Burman实验设计，对蔗糖、（NH4）2HPO4、KH2PO4、MgSO4、玉米浆、CaCO3进行考察，另外取5个虚拟项进行误差估计，并取3组实验中心点作为对照。每个因素取2个水平，高水平编码为+1，低水平编码为-1，实验中心点编码为0，以可得然胶的得率为响应值，各因素取值水平见表1。

表1 Plackett-Burman实验因素与水平Table1 Levels and factors of Plackett-Burman

1.3.2 最陡爬坡实验设计 在最陡爬坡实验在Plackett-Burman实验设计得到的多元一次方程的基础上，根据其系数的正负及大小，来确定坡爬的方向和步长，正因素增加用量，负因素减少用量[14]。设计主要因素蔗糖、（NH4）2HPO4、MgSO4、玉米浆的最陡爬坡实验。

1.3.3 响应面分析实验 根据Box-Behnken实验的实验原理，利用Design Expert 8.0软件，在爬坡实验结果的基础上，以蔗糖、MgSO4、玉米浆、（NH4）2HPO4为因子，以可得然胶得率为指标，进行4因素3水平实验，因素水平表见表2。

表2 Box-Behnken实验因素与水平Table2 Levels and factors of Box-Behnken

1.4 数据处理

利用Design Expert 8.0进行数据处理。

2 结果与讨论

2.1 Plackett-Burman实验

按照N=12的Plackett-Burman设计进行实验，每组3个平行，响应值为3组平行实验得率的平均值。Plackett-Burman实验设计及响应值见表3，各因素效应及显著性分析见表4。

表3 Plackett-Burman实验设计与结果Table3 Plackett-Burman experimental design and results

表4 各因素效应值及显著性分析Table4 Various factors effect value and significance analysis

6 个因素对响应值的影响大小依次是：A＞D＞F＞B＞C＞E，即蔗糖＞MgSO4＞玉米浆＞（NH4）2HPO4＞KH2PO4＞CaCO3，其中A（蔗糖）、B（（NH4）2HPO4）、D（MgSO4）和F（玉米浆）对可得然胶的影响显著，因此以上4个因素是影响可得然胶得率最重要的因素，而其他成分对可得然胶产量影响不显著[15]。

多元回归方程：Y=39.92+4.68A+1.43B-0.93C-1.91D+0.74E+1.69F。模型的决定系数R2=92.12%，表明该模型拟合较好，具有较高的可信度。且整体模型的p值＜0.001，表明该多元回归方程高度显著[16]。

2.2 最陡爬坡实验

响应面拟合方程只有在邻近区域内才能更接近真实情况，在其他区域内的拟合方程毫无意义。因此快速逼近最大响应区域才能有效地建立响应面拟合方程[17]。由PB实验分析可知，A、B和F在方程中系数为正，是显著正因素，在最陡爬坡实验中其用量应增加；D在方程中系数为负，是显著负因素，在最陡爬坡实验中其用量应减少。由于其他因素的影响效应非常小，所以将其维持原始水平，对A、B、D、F进行最陡爬坡实验，根据效应的大小来确定爬坡步长，以尽快逼近最大响应区域，实验设计与结果见表5。

表5 最陡爬坡实验设计与结果Table5 Design and results of the steepestascentexperiment

2.3 Box-Behnken实验设计和响应面分析

由表5可知，最优条件在第3组附近，因此将其作为后续响应面实验的中心点。根据最陡爬坡实验确定的Box-Behnken设计的中心点，设计4因素3水平实验。Box-Behnken实验设计及结果见表6，为使拟合方程具有旋转性和通用性，中心点重复5次。

表6 Box-Behnken实验设计与结果Table6 Box-Behnken experimental design and results

以可得然胶得率为响应值，根据表6的实验结果，用Design Expert 8.0软件对数据进行二次回归分析。得到的回归方程为y=47.24+1.18A-0.56D-0.15F-0.05B+0.6AD-0.1AF-0.12AB-0.57DF-0.4DB-0.87FB-6.14A2-1.44D2-F2-1.1B2。方程的回归系数检验与方差分析见表7。

表7 回归方程方差分析表Table7 Analysis results of regression and variance

根据表7的分析可以看出，模型的相关方差R2= 96.4%，调整后的R2=96.15%，说明通过Design Expert 8.0软件设计出的模型与实际实验的拟合很好，该模型可以很好地预测可得然胶发酵培养基组分与得率之间的关系。且整体模型的p＜0.0001，表明该二次方程模型极其度显著，可以用来对响应值进行预测，从而获得最佳的培养基组成。

根据表7的检验结果，A（蔗糖）和D（MgSO4）对得率得影响均显著，F（玉米浆）和B（（NH4）2HPO4）的影响不显著。二次项影响显著且系数为负，说明抛物面开口向下，有最大值。

利用Design Expert 8.0软件，以得率最大为目标进行培养基优化。得到的最终优化结果为：蔗糖60.88g/L、MgSO40.97g/L、玉米浆2.48m L/L、（NH）42HPO42.41g/L，此时预测的得率最大值为47.96g/L。

为了更直观地描述4个因素对响应值的影响，做出模型分析图，见图1～图6。响应面分析图是特定的响应值y与因素A、B、D、F构成的三维空间在二维平面上的等高图。在每个分析图中，对2个因素进行分析，其余2个因素固定在零水平，可以直观地反映出各因素的交互作用及对响应值的影响。

图1～图6中几个曲面的极值点不明显，但可较直观地看出各因素及其交互作用对可得然胶得率的影响，具有一定的参考价值。

图1 （蔗糖、硫酸镁）响应面分析图Fig.1 Response surface analysis chart（sucrose，MgSO4）

图2 （硫酸镁、玉米浆）响应面分析图Fig.2 Response surface analysis chart（MgSO4，corn syrup）

图3 （蔗糖、玉米浆）响应面分析图Fig.3 Response surface analysis chart（sucrose，corn syrup）

图4 （蔗糖、磷酸氢二铵）响应面分析图Fig.4 Response surface analysis chart（sucrose，（NH4）2HPO4）

图1～图3表明玉米浆对可得然胶得率影响的显著性不明显，而蔗糖和MgSO4对得率的影响较为显著，过高或过低的蔗糖和MgSO4用量都会使可得然胶的得率降低，其中蔗糖的影响更为显著，蔗糖和MgSO4的用量有最适值。图5表明（NH4）2HPO4对可得然胶得率影响不明显。图6进一步验证了玉米浆和（NH4）2HPO4对可得然胶得率的影响均不显著，与方差分析结果吻合。

图5 （硫酸镁、磷酸氢二铵）响应面分析图Fig.5 Response surface analysis chart（MgSO4，（NH4）2HPO4）

图6 （玉米浆、磷酸氢二铵）响应面分析图Fig.6 Response surface analysischart（corn syrup，（NH4）2HPO4）

2.4 最佳培养基条件验证

为了验证实验设计的可靠性，对上述的优化条件进行3次验证实验，并根据实际情况，将配方调整为蔗糖61g/L、MgSO41g/L、玉米浆2.5m L/L、（NH）42HPO42.4g/L，由于其他因素的影响效应非常小，所以将其维持原始水平，即KH2PO41.4g/L、CaCO31.4g/L。可得然胶平均产量为47.73g/L，与预测值十分接近。说明利用响应面法寻求最佳培养基的方法是完全可行的，可得然胶的得率也得到了很大的提高。

3 结论

通过对可得然胶发酵培养基进行响应面优化研究，最终确定最佳的发酵培养基组分为：蔗糖61g/L、MgSO41g/L、玉米浆2.5m L/L、（NH4）2HPO42.4g/L、KH2PO41.4g/L、CaCO31.4g/L，可得然胶的得率高达47.73g/L，比优化前提高了35.6%，比他人研究结果[8]提高了56.49%。

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