超微粉碎技术对中草药制剂的增效作用研究

■李铁梁 罗 琳马志宏邢 薇姜 娜夏 磊

（1.北京市水产科学研究所，北京 100068；2.北京鑫洋水产高新技术有限公司，北京 102488）

中草药是中国医药中的瑰宝，其毒副作用小、不易造成环境污染，而且含有多种免疫调节成分，如生物碱、多糖、皂甙、挥发油、有机酸等[1]。中草药作为抗菌药、生长促进剂、免疫调节剂已经在养殖业中得到了广泛的应用[2-3]。利用现代超微粉碎技术加工中草药，可以提高植物细胞破壁率，从而提高其成分溶出率、生物利用率，更好地改善中草药剂型、药效[4-5]。本实验采用兽用国标中草药三黄粉和肝胆利康散，以锦鲤为实验动物，研究、对比超微粉碎技术加工的中草药与普通粉碎中草药的作用效果，以期通过本实验为天然物中草药的制备工艺提供一些新的思路与参考。

1 材料和方法

1.1 实验用锦鲤

本实验锦鲤购自北京金竹园锦鲤养殖场，选取体质健康、规格相近的红白种锦鲤为实验用鱼，平均体长为13.5 cm，平均体重为55.6 g。

1.2 实验饲料

实验基础饲料选用市售锦鲤饲料。

1.3 实验用中草药

实验用中草药为市售三黄粉、肝胆利康散（80目）成品及超微粉碎的三黄粉、肝胆利康散（300目）[4]、兽用药物氟苯尼考，以上药物均由北京鑫洋水产高新技术有限公司提供，药品符合国家兽药标准要求。

1.4 主要试剂及仪器

超氧化物歧化酶（SOD）、碱性磷酸酶（AKP）、谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）测定试剂盒均购自南京建成科技有限公司；血清总蛋白（TP）试剂盒（批号：03183743190）、血清白蛋白（ALB）试剂盒（批号：03183688122）均由德国诊断有限公司生产；NBT（Nitrotetrazolium Blue Chloride）试剂购自Amresco，三氯叔丁醇购自国药集团化学试剂有限公司；全自动生化仪为ROCHE COBAS/C501型，全波段酶标仪为Biotek ECO型；超微粉碎机为青岛海纳威微粉工程有限公司生产的HZM-200型。

1.5 攻毒实验所用菌株为中国普通微生物菌种保藏管理中心提供的锦鲤溃疡病致病菌维氏气单胞菌(Aeromonas Veronii)[6]，菌株编号：CGMCC No.7231。

1.6 实验方法

1.6.1 三黄粉预防性实验

以投喂不添加药物的基础料的锦鲤为阴性对照组；以投喂添加0.2%氟苯尼考的料的锦鲤为阳性对照组；以分别添加1%普通三黄粉和1%超微粉三黄粉料的锦鲤为两个实验组，每组设3个重复，每个重复12尾鱼。阴性对照组自始至终投喂基础料；阳性对照组和实验组在投喂连续7 d实验料后连续投喂7 d阴性对照料，接着再连续投喂7 d实验料。投喂实验结束后使用锦鲤溃疡病致病性维氏气单胞菌（Aeromonas Veronii）攻毒实验锦鲤。通过预实验确定对实验锦鲤的半致死浓度数量级为106cfu/ml，实际攻毒浓度为8.8×106cfu/ml，采取背部肌肉注射，注射剂量为0.3 ml/尾，实验组、对照组均注射，攻毒后各组均投喂普通基础料；观察两周记录各组的发病鱼数量、死亡数量及死亡时间，实验结束后统计发病率和死亡率。

1.6.2 肝胆利康散实验

以不添加药物的基础料为对照组，分别添加0.2%普通粉碎和超微粉肝胆利康散的饲料为实验组，每组均设3个重复，每个重复10尾鱼。持续投喂3周后，将各组鱼用0.5‰三氯叔丁醇麻醉后，称体重，尾静脉取血，置于肝素抗凝管中；取100 μl全血用于NBT的检测；剩下的抗凝血于4℃条件下3 000 r/min离心10 min，收集上清液于-80℃保存，用于测定超氧化物歧化酶（SOD）、碱性磷酸酶（AKP）、谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）、血清总蛋白（TP）和血清白蛋白（ALB）。

1.7 饲养管理

各个养殖桶分别投喂相应饲料，每天投喂3次，分别为9:00、13:00和17:00，按体重的2%～3%饱食投喂；注意观察鱼的摄食情况并详细记录，另外，详细记录发病鱼、死亡鱼的数量及死亡时间，并对死鱼进行称重、记录，溶氧保持在5 g/min以上，水温不低于20℃。

1.8 指标检测方法

1.8.1 NBT检测：取锦鲤静脉血与0.2%NBT溶液等体积混合，室温孵育30 min；取45 μl混合液到900 μl N,N-二甲基酰胺中，充分混匀；常温，2 000 r/min离心5 min；设3个重复，每个重复取200 μl离心上清液到石英酶标板中，540 nm下比色读取OD值。

1.8.2 超氧化物歧化酶（SOD）、碱性磷酸酶（AKP）、谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）、血清总蛋白（TP）、血清白蛋白（ALB）检测均按相关试剂盒使用说明中的方法操作。

1.8.3 计算公式

发病率(%)=有典型症状的鱼/实验组鱼的数量×100。

平均发病率（%）=实验组发病率之和/实验组重复数×100。

死亡率（%）=死亡鱼的数量/实验组鱼的数量×100。

平均死亡率（%）=实验组死亡率之和/实验组重复数。

血清球蛋白=血清总蛋白（TP）-血清白蛋白（ALB）。

血清白球比=血清白蛋白值/血清球蛋白值。1.8.4 统计方法

本实验数据统计分析在STATISTICA 7.0环境下进行。实验结果用“平均数±标准差”表示，对数据进行单因素方差分析（ANOVA），并结合Duncan's法进行多重比较，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 三黄粉实验结果

攻毒后第2 d，部分锦鲤即出现了典型的溃疡病症状：体表注射部位隆起；随着病症的发展，注射部位出现红肿、鳞片脱落的症状，部分锦鲤体表溃烂、肌肉外露[6]，重症时，实验鱼停止进食，开始出现死亡。从表1可以看出，三黄超微粉组对锦鲤溃疡病有着明显的预防保护作用，其效果要显著优于添加普通三黄粉的实验组以及添加氟苯尼考的阳性对照组（P＜0.05）；实验中对病鱼症状的实时观察也显示，三黄超微粉组鱼的发病症状要比其它各组轻，实验结束时，部分出现症状的实验鱼已经痊愈；而添加了普通三黄粉的实验组对该病的预防作用与阳性、阴性对照组则无显著差异（P＞0.05）。

表1 攻毒实验中锦鲤发病率统计

表2结果显示，攻毒实验的第3 d，阴性对照组和普通三黄粉组的锦鲤开始出现死亡，阳性对照组在第5 d开始出现死亡，而添加超微粉三黄粉实验组在第10 d才出现死鱼，且只有其中一个重复死了2尾，其余两个重复从始至终均无死鱼出现。统计结果也显示，超微粉组的死亡率要显著低于其余各组（P＜0.05）；而添加普通三黄粉的实验组死亡率与阳性、阴性对照组则无显著差异（P＞0.05）。

表2 攻毒实验中锦鲤死亡率统计

2.2 肝胆利康散实验结果（见表3）

表3结果显示，添加肝胆利康散的两个实验组的NBT值要显著低于对照组（P＜0.05），两个实验组之间无显著差异（P＞0.05）；3个实验组间的谷丙转氨酶（GPT）无显著差异（P＞0.05）；普通粉组的谷草转氨酶（GOT）显著高于其余两组（P＜0.05）；超微粉实验组与普通粉实验组超氧化物歧化酶（SOD）无显著差异，但均显著高于对照组（P＜0.05）；3组的碱性磷酸酶（AKP）水平均无显著差异（P＞0.05）。

表3 肝胆利康散实验数据统计结果

表4所显示的的是所测锦鲤肝功能的指标。结果显示，普通粉组的血清球蛋白（GLOB）明显高于对照组（P＜0.05），而两个实验组间差异不显著，超微粉实验组与对照组之间也无显著差异（P＞0.05）；其它指标各组间均无显著差异（P＞0.05）。

表4 投喂肝胆利康散后锦鲤肝功能指标检测结果

3 讨论

中草药的重要药效成分通常分布于细胞内与细胞间质，且以细胞内为主[7]。植物细胞壁内填充和附加有木质素，因此，细胞壁和细胞群壁具有较强的韧性。普通粉碎的药材粉末，细胞破壁率低，当药物进入动物体内后药粉的粉粒吸水膨胀，有效成分通过扩散不断地从细胞壁和细胞膜释放出来，扩散需要细胞内外具有浓度差，当胞内外浓度差很小或平衡时，有效成分的释放速度将非常缓慢，甚至停止，位于内部细胞中的有效成分有时还来不及释放就被排出体外，因而常常达不到有效的治疗浓度。经过超微粉碎后的中草药，植物细胞破壁率高，有效成分在没进入机体前就暴露出来，进入体内后可溶性成分迅速溶解，即使溶解度低的成分也因超微粉具有较强的附着力而紧紧黏附在胃肠内壁的黏膜上，使在胃肠道停留时间延长、吸收更充分，吸收量也会增加，由于细胞壁大部分在粉碎时被破坏，有效成分则不需通过细胞壁和细胞膜的释放过程，这样从药物的释放速度和释放量上超微粉碎中草药要远优于普通粉碎中草药[4]。

三黄粉由黄芩、黄柏、大黄、大青叶按比例配伍而成，其中黄芩、大黄主要成分为黄芩甙元、大黄酚、鞣酸，具有广谱抗菌、抗炎抗变态等作用，黄柏含有的小檗碱成分能够抑制细菌的呼吸和细菌核糖核酸的合成[8]。迄今为止，三黄粉作为国标兽药已经被广泛应用于鱼类病害防治中，主要用来防治水产动物细菌性疾病[9]。史国富等（2011）[10]证明了超微粉黄芩中的黄芩苷溶出度要大幅高于普通粉黄芩。通过本实验结果还可以看出，投喂超微粉三黄粉的实验鱼发病率、死亡率都显著低于其它实验组（P＜0.05），这充分说明超微粉碎技术大幅提高了三黄粉中中草药的破壁率，使其有效成分得到了充分的释放，而实验鱼对有效成分的吸收利用也较充分，因此实验鱼对超微粉三黄粉的利用率要高于普通粉碎三黄粉，从而成功保护了实验鱼免受攻毒细菌的侵袭。所以利用超微粉碎技术加工三黄粉能够大幅提高药效。

在鱼类的血细胞中，单核细胞、巨噬细胞和各种粒细胞具有吞噬异物的能力[11]，这些吞噬细胞吞噬异物后，产生大量氧自由基，能量消耗剧增，耗氧量随之相应增加，称为呼吸爆发。呼吸爆发是鱼类非特异性细胞反应的主要指标之一，可直接反映出鱼类非特异性免疫能力的大小，而NBT值是直接反映吞噬细胞吞噬活性的一个指标，与鱼体非特异性免疫功能成正相关关系[12]。本研究结果却显示，随着投喂时间的延长，投喂肝胆利康散的两个实验组的NBT值均显著低于对照组（P＜0.05）。肝胆利康散的主要成分为茵陈，茵陈中起作用的是一些有机酸和挥发油，如茵陈二炔、茵陈二炔酮和茵陈炔内酯、醇提取物等挥发油具有促进胆汁分泌和排泄作用，而茵陈香豆酸A和茵陈香豆酸B等有机酸具有利胆作用，因此茵陈具有促进胆汁分泌、保肝、助消化的作用[8]，主要用于预防鱼类因消化不良引起的肝胆综合症[13]。这些有效成分的作用促进了胃酸和胆汁的分泌，从而改变了消化道内的pH值[14]，而肠道pH值的变化又有可能导致了肝脏的免疫偏差和免疫活性抑制[15]，所以NBT活性的降低可能是这种免疫活性抑制的表现之一。

氧自由基是机体内化学性质很活跃且毒性很强的一类物质，能够攻击细胞膜上的脂肪酸产生过氧化物，这些物质是毒性很强的一种物质，它会侵害体内的核酸、蛋白质等而引起一系列的细胞破坏作用。而超氧化物歧化酶(SOD)是存在于机体正常组织当中的清除氧自由基的重要酶系统，其活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力，SOD活性越强，说明机体清除氧自由基的能力越强[16]。本研究结果显示，添加肝胆利康散的两个实验组SOD活力水平都显著高于对照组(P＜0.05)，说明该中草药对提高鱼体SOD酶活性，消除氧自由基作用明显。

谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）是广泛存在于鱼类细胞浆和线粒体中的重要氨基酸转氨酶，在鱼体蛋白质代谢过程中起重要作用，是指示肝细胞功能的敏感指标[17-18]。血清总蛋白（TP）、血清球蛋白（GLOB）、血清白蛋白（ALB）以及血清白球比（A/G）等指标在临床上也是肝脏是否病变的必检指标，常和GPT和GOT的活性变化衡量肝脏受损伤的程度[19]。碱性磷酸酶（AKP）是磷代谢过程中的重要酶类，在营养物质的消化、吸收和运转过程中起重要作用，也是动物体内重要的解毒体系，血清中的碱性磷酸酶主要来源于肝脏和骨骼，在一定范围内AKP含量高说明机体的解毒功能较强，也说明肝脏的功能较强[20]。本研究的结果除普通粉实验组的谷草转氨酶（GOT）和球蛋白（GLOB）显著高于对照组外，其余指标之间均无显著差异。肝胆利康散对实验鱼的肝脏及消化指标未能表现出明显的改善作用，也没显示出超微粉的优势，这可能是由于肝胆利康散的主要作用是促进胆汁分泌、提高鱼体对饲料中营养成分利用率的作用，从而减轻鱼体肝脏的负担，降低鱼类患肝脏疾病的风险，在养殖实践中肝胆利康散主要用于改善患肝胆综合症的鱼体的体质[21]；而我们所用的实验鱼均为无肝脏病变的健康鱼，所以体现不出药物对肝脏不正常指标有改善作用，进而也体现不出超微粉肝胆利康散的效果优势。另外据报道，运用超微粉碎技术加工含挥发油成分的中草药会使挥发油流失[22]，肝胆利康散配方中，主剂茵陈主要起作用的成分就是挥发油，所以，超微粉肝胆利康散中挥发油成分的损失也可能是造成其药效不显著的原因之一。

4 结语

综上所述，采用超微粉碎技术加工两种不同的中草药，在锦鲤上的作用效果明显不同，对以鞣质为主要有效成分的三黄粉明显提高了其药效，但对以挥发油为有效成分的肝胆利康散的增效作用则不明显。根据对研究结果的分析，利用超微粉碎技术对中草药的增效作用不能一概而论。经超微粉碎后，中草药挥发性成分的流失率，不同种类中草药最佳粒径的选择，破壁后大分子有机成分有无被破坏，以及由于药物成分溶出率的改变，中草药原组方配伍比例是否需要调整等问题都尚需更深入的研究。