沙葱多糖对绵羊外周血淋巴细胞的调节作用研究

■包美艳 敖长金 赵飞艳 萨茹丽

（内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古呼和浩特 010018）

沙葱（Allium mongolicum regel）属被子植物门（Angiospermae）、百合科（Liliaceae），葱属（Allium），学名蒙古韭，蒙古语称为“胡穆利”，是一种生命力顽强的植物[1]。沙葱有抑菌、抗氧化、提高免疫机能等生物活性。沙葱多糖是沙葱的主要活性成分之一，沙葱多糖具有免疫调节、抗氧化、体外抑菌及调控瘤胃发酵等作用。扈瑞平等[2]研究发现，沙葱多糖通过促进免疫器官的生长发育和小鼠免疫细胞分泌IL-2、TNF-α而发挥免疫调节功能和抗肿瘤作用。宋巴达玛[3]研究发现，沙葱多糖能提高肉羊血清中IL-2、IL-6含量，从而增强机体的免疫机能。淋巴细胞增殖是反映机体细胞免疫水平的一个重要指标，而NO是新发现的一种重要的信使分子。NO具有免疫调节、神经传递作用。因此,研究沙葱多糖对绵羊外周血淋巴细胞增殖、NO与iNOS分泌的影响，为进一步揭示沙葱多糖的免疫调节作用机理提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

沙葱多糖由内蒙古农业大学动物营养与免疫实验室提供，使其终浓度分别为50、100、150、200、250 μg/ml，0.22 μm滤器过滤除菌。MTT（四甲基偶氮唑盐,Amresco公司）用pH值7.2 PBS配成5 mg/ml，0.22 μm滤器过滤除菌，4 ℃避光保存。二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司)；绵羊外周血淋巴细胞分离液（TBD天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）；PBS磷酸缓冲液[HyClone,赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司]；胎牛血清(Gibco公司)；无酚红RPMI1640培养基(Gibco公司)；一氧化氮及诱导型一氧化氮合酶测定试剂盒(南京建成科技有限公司)；生物安全柜(Thermo)；CO2培养箱(Heal Force)；全自动多功能酶标仪(Biotek Synergy H4,美国)；垂直离心机(Eppendorf,德国)。

1.2 试验方法

1.2.1 绵羊外周血淋巴细胞的分离与培养

在绵羊颈静脉用含肝素钠的无菌采血管采集40 ml血液，2 500 r/min、离心10 min，弃掉上层血浆，下面的血用等体积PBS液稀释，将稀释的5 ml血轻轻叠加在4 ml淋巴细胞分离液层上，经密度梯度离心(22℃、800×g垂直离心30 min)，收集中间层白色云雾状的单个核细胞层，得到的细胞用5倍体积的PBS液(4℃)洗涤细胞2次(2 500 r/min离心10 min)，最后用完全RPMI1640培养液洗细胞1次（2 500 r/min离心10 min）。将细胞重悬在4 ml含10%胎牛血清的完全RPMI1640培养液中。用血细胞计数板计数并调整细胞浓度至5×106个细胞/ml，于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养2 h后，除去贴壁细胞,收集悬浮细胞。用PBS缓冲液洗细胞2次(1 500 r/min,离心10 min)，再用完全 RPMI1640 培养液重悬细胞，即得到绵羊外周血淋巴细胞。

1.2.2 绵羊外周血淋巴细胞增殖反应的测定

将上述淋巴细胞用RPMI1640培养液调整细胞浓度为5×106个细胞/ml，并分为空白对照组（PBS）和不同浓度的试验组接种于96孔培养板中，每孔总体积100 μl，每组设6个重复孔。试验组添加沙葱多糖的终浓度分别为50、100、150、200、250 μg/ml。置于37 ℃、5%CO2及饱和湿度下培养24、48、72 h。每次试验结束前4 h，每孔加5 mg/ml的MTT溶液20 μl，继续培养4 h。在每孔加入二甲基亚砜（DMSO）100 μl，振荡15 min，充分溶解结晶。在酶标仪570 nm波长下测各孔吸光度（OD570），作为淋巴细胞增殖的指标。试验重复3次。

1.2.3 绵羊外周血淋巴细胞NO含量的测定

将上述的淋巴细胞用含10%胎牛血清的无酚红RPMI1640培养液调整细胞浓度为8×106个细胞/ml，以无酚红RPMI1640培养液作空白对照组，试验组添加沙葱多糖的终浓度分别为50、100、150、200、250 μg/ml。接种于24孔培养板中，每孔1.0 ml，每组设6个重复孔。于37℃、5%CO2及饱和湿度下培养24 h后取100 μl细胞培养液测定NO含量，用酶标仪在550 nm处测定吸光度（OD值）。计算公式：NO含量（μmol/l）=（OD1-OD3）/(OD2-OD3)×C×稀释倍数（其中OD1为测定孔吸光度值；OD2为标准孔吸光度值；OD3为空白孔吸光度值；C是标准孔浓度20 μmol/l；稀释倍数为4）。

1.2.4 绵羊外周血淋巴细胞iNOS活性的测定

以硝酸还原酶法测定iNOS活性。测定方法根据试剂盒说明书进行。计算公式：iNOS活性(U/ml)=（OD1-OD2）/38.3×10-6×2.51+A/A×1/1×15/1 000(其中OD1为测定孔吸光度值；OD2为空白孔吸光度值；A为细胞培养上清液)。

1.3 数据处理

试验结果用“平均值±标准差（X±S.D.）”表示,采用SAS（9.0）统计软件作单因素ANOVA方差分析；多重比较采用Duncan's法。

2 结果

2.1 沙葱多糖对绵羊外周血淋巴细胞增殖的影响（见表1）

表1 沙葱多糖对绵羊外周血淋巴细胞增殖的影响

从表1可见，各作用时间段内沙葱多糖浓度为50～100 μg/ml时抑制淋巴细胞的增殖，与对照组相比差异不显著（P＞0.05）。沙葱多糖浓度为150～250 μg/ml时促进淋巴细胞的增殖。随着沙葱多糖浓度的加大，对淋巴细胞增殖作用也增强。沙葱多糖作用24、48、72 h后，淋巴细胞增殖作用依次显著减弱（P＜0.05），各浓度组在3个作用时间点之间均差异显著，呈现时效关系，其中沙葱多糖24 h、250 μg/ml组对淋巴细胞增殖作用最强，与对照组相比差异极显著（P＜0.01）；而72 h、50 μg/ml组对淋巴细胞增殖作用最弱，与对照组相比差异不显著（P＞0.05）。

2.2 沙葱多糖对绵羊外周血淋巴细胞NO含量及iNOS活性的影响（见表2）

表2 沙葱多糖对绵羊外周血淋巴细胞NO及iNOS含量的影响(n=6)

由表2可见，沙葱多糖浓度为50～100 μg/ml抑制NO的分泌，随着浓度的加大，150～250 μg/ml淋巴细胞内NO的含量有增加趋势，其中浓度为250 μg/ml淋巴细胞内NO的含量最高，与对照组相比差异显著(P＜0.05)，其他各组差异均不显著(P＞0.05)。沙葱多糖各个浓度组与对照组相比，对iNOS的影响差异不显著(P＞0.05)，250 μg/ml沙葱多糖组iNOS活性最高。

3 讨论

3.1 沙葱多糖对绵羊外周血淋巴细胞增殖的影响

细胞增殖试验是测定免疫细胞功能的方法之一。淋巴细胞受到各种因子刺激时会发生细胞增殖。在细胞增殖过程中，细胞的代谢处于旺盛状态。细胞增殖需要大量的能量，以供合成各种大分子物质和完成分裂过程。因此，细胞能量代谢的水平往往可以间接反映细胞增殖情况。Mosmann根据这一原理首创了MTT比色分析方法[4]。

赵现敏等[5]报道，将4种中药多糖(板蓝根多糖、牛膝多糖、山药多糖和黄芪多糖)用MTT比色法比较对猪脾淋巴细胞增殖的影响，结果表明，4种多糖均能显著刺激用ConA或LPS诱导的猪脾淋巴细胞增殖。聂小华等[6]报道,黄芪多糖对ConA诱导的小鼠脾脏T淋巴细胞增殖具有显著的促进作用。王德云等[7]研究了4种浓度(150、300、600和1 200 μg/ml)的黄芪多糖对培养的鸡脾脏淋巴细胞增殖的影响,发现黄芪多糖在150 μg/ml时协同ConA或LPS刺激淋巴细胞增殖的作用最强,并提出中药成分对体外淋巴细胞的增殖作用具有一定的量效关系。邱妍等[8]研究发现，牛膝多糖能促进雏鸡外周血T淋巴细胞增殖,并有一定的量效和时效关系。本试验研究结果表明，沙葱多糖浓度为50～100 μg/ml时抑制淋巴细胞增殖，高浓度组（150～250 μg/ml）促进淋巴细胞增殖，并且各浓度组在3个作用时间点之间差异显著(P＜0.05)，呈现有一定的量效和时效关系。这表明沙葱多糖在体外对淋巴细胞增殖有调节作用。

3.2 沙葱多糖对绵羊外周血淋巴细胞一氧化氮、诱导型一氧化氮合酶含量的影响

一氧化氮是一氧化氮合成酶催化L-精氨酸末端胍基中的一个氮原子氧化而生成的产物,参与体内多种生理病理过程。一氧化氮的体内作用具有双重性，既有保护作用，又有损伤作用。研究表明，巨噬细胞可受TNF、IFN2-γ等细胞因子和内毒素脂多糖诱导活化，合成和释放大量NO[9]。另据文献报道，D-半乳糖诱导的亚急性衰老小鼠皮层NO含量明显增高，提示衰老与NO有关[10]。芦荟多糖刺激体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞24 h，发现巨噬细胞NO生成量增加[11]。香菇多糖或香菇多糖协同干扰素对小鼠巨噬细胞NO的产生具有明显的促进作用，香菇多糖也可以升高脾细胞内的Ca2＋浓度、cAMP、cGMP，促进脾淋巴细胞产生NO[12]。NO具有杀伤肿瘤细胞活性，并且可通过增加表面分子诱导细胞免疫[13]。另据研究表明，NO介导广泛的肿瘤毒性[14]，并在肿瘤血管形成、肿瘤浸润和转移过程中起重要作用[15]。NOS信使核糖核酸广泛分布于心血管系统,它在相当短的时间即可被Ca2+激活,并产生少量的NO[16]。Kim等[13]报道，桔梗多糖激活巨噬细胞产生NO而表现出杀伤肿瘤细胞的活性。Currie(1978)提出，激活的巨噬细胞可产生精氨酸酶，使L-精氨酸转变成鸟氨酸和尿素。有学者发现，精氨酸酶抑制NO合成酶，从而抑制巨噬细胞利用L-精氨酸合成NO[17]。陈炅然等[18]研究表明，蕨麻多糖能明显促进体外培养的小鼠脾淋巴细胞增殖和一氧化氮的分泌。丁航等[19]研究发现，香菇多糖能刺激小鼠腹腔巨噬细胞提高iNOS活性和NO的生成。本试验研究结果表明，沙葱多糖浓度为50～100 μg/ml抑制NO的分泌，随着浓度的加大，浓度为150～250 μg/ml淋巴细胞内NO的含量有增加趋势。但沙葱多糖对淋巴细胞内iNOS活性没有显著的作用，沙葱多糖对绵羊外周血淋巴细胞内iNOS活性的影响尚待进一步研究。

4 结论

沙葱多糖在体外通过促进淋巴细胞增殖及NO的释放，表明其对绵羊外周血淋巴细胞具有免疫调节作用。