红曲霉和酵母菌混合发酵制备合生元的条件研究

■陈天龙 张 敏

（延边大学，吉林延吉 133000）

随着百姓生活水平的提高及健康和环保意识的强化，人们逐渐把无公害、无污染、安全、优质的绿色畜禽产品作为餐桌上的主要消费品。由于养殖业长期进行不合理的抗生素使用引发细菌耐药性,使畜禽体内菌群失调并造成二度感染,引起畜禽机体免疫力下降,且常有药物残留于动物产品及环境当中的状况发生。针对养殖业使用抗生素等饲料添加剂所造成的危害,研究开发新型绿色饲料添加剂就显得尤为重要。红曲霉早在我国的食品加工业中得到过广泛的应用，近年研究又发现红曲霉次级代谢产物具有保健和药用价值。酵母菌是在养殖业中应用比较早的微生物添加剂，其代谢产物的安全性和营养价值已被养殖业认可，并得到广泛的应用，但未见关于红曲霉与酵母混合制备合生元的报道。

本试验是利用混菌之间有共生和互补的营养作用，能克服发酵过程中产生的不利的影响，增加发酵的效果，试验宗旨筛选出红曲霉菌和酵母菌混合发酵制备合生元的最佳比例，并找出最佳混合发酵的时间，最佳混合发酵的温度。为红曲霉-酵母菌合生元能在未来的畜禽生产中应用推广提供理论依据，为饲料添加剂行业开发新的微生物代谢物添加剂资源奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

红曲霉、酵母菌由延边大学动物营养实验室提供。

1.1.2 材料

去皮马铃薯、蔗糖、琼脂、水。

1.1.3 主要试剂

琼脂粉、葡萄糖、0.2%冰乙酸。

1.1.4 主要器材

加热锅、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、玻璃培养皿、接种环、分光光度、凯式定氮仪。

1.2 方法

PDA培养基（土豆培养基）的制作：将马铃薯去皮、挖掉芽眼后称量200 g，切成1 cm见方的小方块。将切好的马铃薯块加适量水后放入锅中加热，煮至酥而不烂。用双层沙布过滤，取滤汁，放在加热锅中加入20 g糖。在沸腾状态下加入15 g琼脂，边加边搅拌,直到琼脂完全溶化为止，用蒸馏水定容至1 000 ml。装入玻璃平皿内，约0.5～0.7 cm深，高压灭菌25 min晾凉待用。

1.2.1 菌种间相容性试验

将红曲霉和酵母菌分别接种在PDA培养基上活化培养72 h后放在4℃冰箱中保存待用。把酵母菌接种到接有红曲霉的PDA固体培养基上。取两个PDA平板作为对照，分别接种红曲霉和酵母菌,于适合大多菌体生长的温度32℃恒温培养7 d(红曲霉在土豆培养基中的生长周期)后观察生长情况。

1.2.2 发酵条件优化单因素筛选试验

1.2.2.1 发酵时间

先在6个PDA固体培养基上接种红曲霉，32℃培养7 d，第1～6 d每天在一个接有红曲霉的培养基平板上接种等量的酵母菌。观察各组生长状况，测定莫纳可林K含量、蛋白质含量,确定最佳发酵时间。

1.2.2.2 接种比例

将配制比例分别为红曲霉∶酵母菌比为1∶3，2∶5，1∶2，1∶1，2∶1，5∶2，3∶1的比例接种到培养基中，于适合大多菌体生长的温度32℃恒温培养7 d，测定莫纳可林K含量、蛋白质含量,确定最佳发酵比例。

1.2.2.3 发酵温度

按照上述接种比例将红曲霉和酵母菌接种于PDA培养基中，分别于29、30、31、32、33、34 ℃进行培养，培养发酵7 d结束后，测定莫纳可林K含量、蛋白质含量,确定最佳发酵温度。

1.2.3 最佳条件下的发酵培养试验

用两只三角瓶内装0.2%的冰乙酸溶液少许，装入土豆培养基的平皿冷却后取已培养的红曲霉分5～8次注入到10 ml的0.2%的冰乙酸溶液中，取3 ml接种于土豆培养基上，于32℃的培养箱内培养4 d然后取已培养的酵母菌同样分5～8次注入到10 ml的0.2%的冰乙酸溶液中，取1 ml接种于已经培养4 d的接有红曲霉的土豆培养基上,继续于32℃的培养箱内培养至第7 d。

烘干：将培养好的红曲霉与酵母菌混合湿粉摊入容器内，放入55℃的烘箱内，干燥12～14 h，然后取出粉碎制成粉状。

1.2.4 测定指标

发酵产物中,Monacolink的测定采用紫外分光光度法。

发酵产物中蛋白质含量测定采用凯式定氮法。

2 结果与分析

2.1 菌种兼容性试验

从兼容性试验的结果来看,红曲霉的生长与酵母菌比较相对较慢,酵母菌先长满整个平板，说明两者之间可以兼容共生，但红曲霉菌丝生长多少受到一些抑制，也许因为酵母菌生长的更快，争夺了红曲霉的生长空间，使它无法快速生长，长满整个平板需要较长的时间。

2.2 发酵条件的优化单因素筛选

2.2.1 发酵时间

图1 发酵时间对混合菌种发酵的影响

从图1可以看出，蛋白含量、Monacolink含量在红曲霉发酵的第4 d接种酵母菌均达到最高，此后继续接种发酵结果则相反。因为菌体生长到达稳定期和最高生长期时，菌种数量最多，代谢产物最多，产酶量最大,蛋白含量最高,菌种过了最高生长期，菌丝数量减少,从而使代谢产物和蛋白含量都降低。故最适宜的发酵接种时间为红曲霉发酵接种的第4 d。

2.2.2 接种比例

从图2可以看出混菌接种比例为红曲霉∶酵母菌为3∶1时，蛋白含量、Monacolink含量达到较理想的水平，而其它接种比例会使蛋白含量最低而Monacolink含量很高或者蛋白含量最高而Mo⁃nacolink含量很低。当接种比例不适宜时，混合菌种互相又竞争生长空间和养分，既而导致微生物菌群生长不好，也符合上述菌种兼容试验的结果，故最适宜的接种比例为3∶1。

图2 接种比例对混菌发酵的影响

2.2.3 发酵温度

图3 发酵温度对混菌发酵的影响

从图3可以看出，混菌发酵温度在32℃时蛋白含量、Monacolink含量均达到最高。故最适宜的发酵温度为32℃。

2.3 最优化条件的实践发酵试验

经试验确定了红曲霉、酵母菌混合发酵制备合生元的最佳条件为：混合菌种（红曲霉∶酵母菌=3∶1）在32℃，在红曲霉接种培养4 d时接种酵母菌混合发酵至第7 d。对在最佳培养条件下培养获得的发酵产物进行蛋白质和Monacolink含量的测量，结果见表1。

表1 最优条件下发酵后蛋白和Monacolink含量

3 讨论

合生元(synbiotics)是一种益生素与益生元(prebiotics)复合性的生物制剂,是目前关于绿色饲料添加剂中研究较多的一种新型微生态制剂。由于合生元自身组成的特殊性，其在动物体内可同时发挥益生素与益生元的双重作用，具备选择性促进肠道中有益活菌定植作用，从而达到提高动物健康水平的目的，间接提高动物的生产效率。

本试验所研究的红曲霉和酵母菌双菌发酵制备的合生元是一种新型无公害、绿色的微生物饲料添加剂。红曲霉菌在生长过程中能够产出丰富的活性酶类,红曲色素和Monacolink等，其代谢产生的红曲色素和活性酶类具有很强的益生作用,而Mona⁃colink具有显著的抑制胆固醇合成的作用,同时可明显改变畜产品质量。酵母菌无论对于单胃动物还是反刍动物都不可缺少的益生菌。酵母菌在提供给动物优质菌体蛋白时,还同时提供给动物大量的B族维生素,可明显提高动物的生产效率。通过实验室内的微生物培养实验研究,发现红曲霉和酵母菌可以兼容共生,但由于两菌种在相同环境下生长周期和生长能力不同而有一定拮抗作用,通过混合菌种优化条件的筛选，能降低竞争抑制,达到最佳培养效果。

红曲霉和酵母菌混合制备合生元的条件一旦研究成熟，其作用就会具备双重功效，既能提高畜禽机体免疫能力,又能促进动物体内营养素的吸收，并可以改善畜禽消化道内环境。在畜产品生产中可有效抑制脂肪和胆固醇在畜禽产品中的沉积。畜禽生产中使用合生元，不必担心药物和铜、铁、锌在畜产品中的残留，更不必担心添加剂对环境的污染问题。此项目研究如果可继续做动物生产试验和畜产品品质影响试验，就可以进一步证实该项研究在动物生产中的可应用性,在养殖业上也一定具有应用价值。

4 小结

试验结果表明，酵母菌与红曲霉之间存在拮抗作用但是可以共生,但需要控制适当的混合发酵的条件才能达到较理想效果；最佳混合发酵条件：在PDA培养基上，混合菌种（红曲霉∶酵母菌=3∶1）在32℃的环境温度下，在红曲霉接种培养4 d时接种酵母菌混合发酵至第7 d，发酵产物中蛋白含量、Monacolink含量，达到较理想的水平。

（参考文献若干篇，刊略，需者可函索）