蛋氨酸脑啡肽对禽马立克细胞株（MSB-1）增殖的影响

■魏 澍 刘金玲 单风平 孙婷婷 赵 鹭 王艺凝

(1.辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳 110164；2.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110866；3.中国医科大学免疫教研室，辽宁沈阳 110001)

鸡马立克氏病（Marek's Disease，MD）是由马立克氏病毒（Marek's Disease Virus,MDV）引起的一种淋巴细胞增生性肿瘤疾病，通常以外周神经和包括虹膜及皮肤在内的其他各种器官和组织的单核细胞浸润为特征。2005年，欧洲、澳大利亚、南美洲、亚洲相继发生了MD强毒株的流行，死亡率在50%～60%，在 2008年到2011年，我国四川和新疆等地区相继爆发了该病，死亡率为15%～80%，给我国的养禽业造成的损失达数千万元甚至上亿元。由于MDV有向更强毒力进化的倾向，现有疫苗并不能对所有的强毒株提供完全的保护，免疫失败屡有发生，造成该病在局部地区爆发，给本病的防制带来了新的问题]。蛋氨酸脑啡肽（MENK）是一种内源性的阿片肽，具有可逆性，无细胞毒性，近年来研究发现，适宜浓度的MENK通过作用于免疫细胞，激活免疫系统细胞，发挥免疫调节作用和肿瘤杀伤的作用。因此，MENK对MSB-1细胞也可能存在增殖抑制及凋亡促进作用，目前尚未见相关文献报道。本实验以体外培养的禽马立克细胞株MSB-1为研究对象，探讨MENK对MSB-1细胞形态学、增殖抑制率及早期凋亡率的影响，为进一步深入研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

禽马立克MSB-1细胞株(沈阳农业大学生化教研室保存)；蛋氨酸脑啡肽(中国医科大学免疫教研室赠送)；Anmexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物发展有限公司）；四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）购自鼎国生物技术公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

使用10%胎牛血清，青链霉素各100 U/ml的RPIM-1640培养液培养置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养MSB-1细胞，每3 d传代1次，取对数生长期的细胞用于试验。

1.2.2 细胞形态学观察

在培养的过程中，将细胞分为RPIM-1640空白对照组和10-12mol/l MENK处理组并用倒置显微镜观察不同时间点MSB-1细胞形态的变化。

1.2.3 MTT法检测MENK对禽马立克细胞株MSB-1增殖的影响

取对数生长期MSB-1细胞，调整细胞密度为(2～5)×104个/ml，每孔200 μl(约103个细胞)接种于96孔培养板内，培养4 h，MENK组加入终质量浓度为10-12mol/l的MENK，各设3个复孔，分别在24、48、72 h后加入MTT溶液20 μl（5 g/l），培养4 h后吸弃培养基，加入150 μl DMSO，震荡10 min用酶标仪在490 nm波长下测定各孔吸光度值(A)，计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率(%)=l-(实验组A值/对照组A值)。

1.2.4 细胞凋亡率的检测

收集对数生长期的MSB-1细胞，密度为1×105个/ml。并接种到六孔板中，每孔加入细胞悬液200 μl及 RPIM-1640培养基2 ml，于 37 ℃、5%CO2培养箱中培养，MENK处理组加入10-12mol/l MENK干预，并设RPMI-1640空白对照组继续培养24 h。收集MSB-1细胞，4℃ 1×PBS洗涤细胞2次后弃上清液，加入BindingBuffer调整细胞密度为5×105个/ml，取0.1 ml细胞悬液至流式管中，加入Annex⁃in V-FITC和PI各5 μl混匀,4 ℃避光反应30 min。加人400 μl BindingBuffer，流式细胞仪检测凋亡细胞所占的比例。

1.3 数据处理

用SPSS（17.0）统计软件对数据进行处理，数据以平均值±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 细胞形态学观察

倒置显微镜下观察RPIM-1640对照组和10-12mol/l的MENK处理组的禽马立克细胞株MSB-1细胞，可见对照组MSB-1细胞呈悬浮生长，细胞呈圆形或梭形，边缘整齐，胞质透亮生长状态良好，分布密集，而MENK处理组在培养24 h后，胞质透亮度下降，界限不清，颗粒感增强，并见细胞碎片逐渐增多，细胞体积变小(见图1)。

图1 倒置显微镜下细胞形态变化(400×)

2.2 MENK对MSB-1的增殖抑制率

用MTT比色法检测各组细胞的增殖抑制情况，统计结果显示10-12mol/l的MENK能够抑制MSB-1细胞株的增殖，并且这种抑制具有时效性，在24 h和48 h MENK处理组细胞的增殖抑制率明显低于RPIM-1640对照组，差异极显著(P＜0.01)，在 72 h 时差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 各组吸光度检测结果（X±S）

2.3 MENK诱导细胞凋亡发生的比率

细胞凋亡率流式细胞仪图示中以AnnexinV为横轴，PI为纵轴表示MSB-1细胞的凋亡情况，左上为机械性损伤细胞，右上为晚期凋亡细胞或坏死细胞，左下为阴性正常细胞，右下为早期凋亡细胞。流式统计结果显示，MENK诱导MSB-1细胞早期凋亡率为(62.04±3.32)%，高于RPIM-1640正常对照组[(5.05±0.61)%]，二者差异极显著（P＜0.01），而晚期凋亡及坏死率高于RPIM-1640正常对照组(P＜0.05)，具有统计学意义，见图2。

图2 细胞凋亡检测

3 讨论

对蛋氨酸脑啡肽的早期药用价值研究是将其作为镇痛剂和神经递质来进行的，后来人们认为，MENK不但具有神经内分泌调节活性，也是一类重要的免疫调控因子，于是通过研究蛋氨酸脑啡肽对免疫系统、肿瘤细胞和正常细胞的作用，发现蛋氨酸脑啡肽参与免疫反应的调控、影响细胞增殖，因此人们逐渐将研究重点转移到与免疫系统相关的疾病上，如肿瘤、艾滋病。从1983年起,MENK抗肿瘤的研究已经被大量的体内外实验所证实。Zagon等研究发现，应用10-6mol/l浓度的MENK刺激体外培养人结肠癌细胞(HT-29)，在12～72 h内可明显抑制细胞的生长。Zagon和他的研究团队通过对人头颈部鳞状细胞癌来源的胰腺癌及结肠癌研究证实，MENK对于癌细胞的转移、趋化、定植及粘连等作用的控制具有十分重要的意义，同时MENK对细胞生长具有双向调控作用，即在低浓度时，MENK抑制细胞生长，而高浓度时却促进细胞生长。本课题组前期工作基础表明10-8～10-12mol/l的MENK均具有生物活性，发挥免疫功能，但在10-12mol/l时具有最佳的免疫调控功能，因此本研究采用了10-12mol/l MENK作用禽马立克细胞株MSB-1，发现10-12mol/l的MENK能够明显抑制MSB-1的增殖，抑制率为19%～46%，高于RPIM-1640对照组，倒置显微镜形态学检测结果显示在10-12mol/l MENK作用24 h后，MENK处理组细胞密度逐渐降低，细胞形态也由圆形变得逐渐不规则，甚至皱缩，流式凋亡检测结果表明，10-12mol/l MENK能够诱导MSB-1细胞株的早期凋亡，并且凋亡率显著高于对照组（P＜0.01），从而表明MENK在体外能够诱导MSB-1肿瘤细胞凋亡及坏死发挥抗MSB-1肿瘤作用，是一种潜在的新型抗肿瘤药物。由于本实验为体外实验，MENK在体内对MSB-1细胞的作用和在体外对MSB-1细胞的作用可能并不完全一致，因此下一步我们将通过动物实验进行进一步研究，并探讨MENK抗肿瘤的相关机制为揭示MENK抗疾病的作用提供实验依据。