干热处理对油菜籽蛋白功能特性的影响

■周小泉 王卫国 谢石力 宋永鑫 刘晓芳

(河南工业大学生物工程学院，河南郑州 450001)

菜籽饼粕的蛋白含量在35%～45%，是丰富的蛋白质资源，而且其氨基酸组成较为平衡，与联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)的推荐值相接近[1]。近些年，双低油菜品种的培育和推广在国内取得较大进展，双低菜籽中的硫苷、芥酸等抗营养成分大大降低，为菜籽蛋白的进一步开发利用提供了更为广阔的基础。菜籽粕在生产过程中往往要经过软化、蒸炒、挤压等热处理工艺，在这些过程中蛋白质结构会发生一系列的变化，如氨基酸的氧化变质，Millard反应，亚基的解离及聚合，疏水基团的暴露等，因而在功能性质上也会出现较大的差异。目前国内对菜籽蛋白研究较多的主要是菜籽蛋白的脱毒处理及酶水解菜籽肽的功能性研究[2-3]，关于高温热处理条件对菜籽蛋白结构及功能性质的影响研究鲜有报道。本实验通过对菜籽蛋白进行干热处理，对其功能特性的变化进行剖析，为菜籽蛋白的开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

秦油1号油菜籽：购于河南省郑州市；ANSNH4荧光探针（8-苯胺基-1-奈磺酸铵）：梯希爱有限公司生产；胃蛋白酶（1∶3 000）、胰蛋白酶（1∶250）：北京海贤技贸有限公司生产；其它试剂均为分析纯。

1.2 主要设备仪器

TA Q100-DSC差示扫描量热仪：美国TA公司生产；超细粉碎机：上海嘉定粮油仪器有限公司生产；酶标仪：BioTek公司生产；101A-1B烘箱：上海市实验仪器总厂生产；79-1磁力搅拌器：江苏金坛市医疗仪器生产；TGL-16G离心机：江苏金坛市中大仪器厂生产。

1.3 实验方法

1.3.1 菜籽总蛋白的制备

参考严梅荣[4]等的实验方法，采用碱溶酸沉的方法：称取一定量的脱脂菜籽粕，均匀分散于10倍（W/V）体积的蒸馏水中，调节pH值至10，室温搅拌1 h，其间每隔10 min测定一次pH值，并用1 mol/l的NaOH溶液调节pH值至10.0，然后以4 000 r/min离心20 min，得到上清液；按上述法重复提取两次，合并三次提取液并调节pH值至6，4 000 r/min离心20 min获得沉淀物；复溶沉淀物并调pH值至8.0，冷冻干燥备用。

1.3.2 RP-12S球蛋白及RP-2S清蛋白的制备

菜籽蛋白中12S球蛋白及2S清蛋白的制备参考Ismond[5]、Leger等[6]方法制备。

1.3.3 蛋白热变性温度的测定

采用差示扫描热量仪（DSC）进行测定。实验采用Al2O3作为参比物，气氛为氮气，升温速率5℃/min。通过专门软件进行数据记录和处理得到DSC曲线，峰值点对应的温度即为变性温度。

1.3.4 菜籽蛋白的热处理

根据DSC测定结果（12S球蛋白变性温度为80℃，2S清蛋白变性温度为60℃）选择80℃和高温100℃对菜籽蛋白进行热处理。具体步骤是：称取等量的菜籽蛋白于锥形瓶中，以保鲜膜封口，放入烘箱中分别于80℃和100℃加热处理15、30、60、90和120 min（升到所需温度时开始计时），以未加热的菜籽蛋白作对照。

1.3.5 疏水性的测定

蛋白质表面疏水性(Surface Hydrophobicity)的测定参考RaoA（2002）[7]，用0.01 mol/l的磷酸缓冲液（pH值 7.0）配制一定浓度的蛋白质溶液，离心取上清液，调节其浓度达到（0.005%～0.1%)。取20 μl ANS溶液加到2 ml蛋白质溶液中，混合均匀避光反应15 min，迅速测定混合液的荧光强度，激发波长和吸收波长分别是360 nm和528 nm。以蛋白质浓度对荧光强度作图，直线的初始斜率即是蛋白质的H0。

1.3.6 吸油性的测定

称取0.2 g样品置于10 ml的离心管中，加入5 ml（V1）的大豆油，室温(30±2)℃下静置30 min，4 000×g下离心20 min，剩余油的体积(V2)用10 ml的量筒读取，吸油性用每克蛋白质持油的体积表示，单位为ml/g。

吸油性(ml/g)=（V1-V2）/0.2

1.3.7 乳化性及乳化稳定性的测定

采用离心法(Sathe SK，1982)[8]测定。称取0.1 g样品2份，分别分散于装有2.5 ml蒸馏水的试管中，再加入2.5 ml大豆色拉油。快速振荡5 min，将两管中液体取出倒入带刻度离心管中，1 000 r/min离心3 min，取出离心管，观察乳化情况，记下乳化层高度H1及管中液体高度H2，按下式计算乳化性：

EC（%）=H1/H2×100%

将上述离心管置于80℃水浴中，加热20 min后，用自来水冷却至室温。再次1 000 r/min离心3 min，取出离心管，记下乳化层高度H3及管中液体高度H4，则乳化稳定性为：

ES（%）=H3/H4×100%

1.3.8 溶解性的测定

参考Molina等[9]的实验方法，浓度为1%的蛋白质溶液，调pH值至2、4、6、8、10，搅拌30 min使样品溶解，静置2 min后，将上层液倒入离心管中离心20 min（4 000×g）。取上清液，采用Lowery[10]法测定蛋白质含量。

溶解度（%）=上清液中蛋白含量/样品中蛋白含量×100%。

1.3.9 体外消化率的测定

体外消化实验根据Alexandra等[11]报道的体外消化模型进行，具体操作步骤如下:称取一定量的处理样品悬浮于pH值1.5的HCl中形成1%的溶液，于37 ℃水浴中预热3～5 min;然后，以m(酶)∶m(底物)为1∶50加入一定量的胃蛋白酶，于37℃消化（0、1、5、10、20、30、60、120 min）后取样，120 min后所得的消化液用1 mol/l NaOH调节至pH值7终止消化反应，再以m(酶)∶m(底物)为1∶50加入一定量的胰蛋白酶，分别消化0、1、5、10、20、30、60、120 min，之后取样分析，用于测定氮释放量。

氮释放量的测定：将上述所取样品中加入等体积10%的TCA，于4 000×g离心20 min后，倒出上清液，得到TCA可溶组分。用Lowery法测定可溶性组分中的蛋白及多肽含量。消化过程中氮释放量的计算:

式中：Nt为消化t min时的TCA可溶性氮含量(mg)；No为所取蛋白中的TCA可溶性氮含量(mg);Ne为所加酶中的TCA可溶性氮(mg);Ntot为分离蛋白的总氮量(mg)。

2 实验结果与分析

2.1 菜籽蛋白热变性温度的测定

图1 菜籽蛋白DSC图谱

菜籽储藏蛋白中主要包括两种蛋白：12S球蛋白和2S清蛋白，前者占蛋白质含量的25%～65%，后者为13.4%～46.1%[12]。DSC结果显示12S球蛋白和2S清蛋白的变性峰非常对称，变性温度分别在81℃和60℃左右，12S球蛋白比2S清蛋白的热稳定性更高，这与Yetunde L Folawiyo[13]的研究结果相一致。而SPI的变性峰则不对称，变性峰顶温度为50～90℃，这是由于提取的SPI中，还具有小分子量的蛋白（如硫堇、胰蛋白酶抑制剂和脂转移蛋白质）以及部分非蛋白成分，使得多种组分的变性峰发生重叠，错落，呈现一定的不规则性。本实验通过选取较高的处理温度80℃和100℃对菜籽蛋白进行处理。

2.2 热处理对可溶性蛋白疏水性的影响

图2 菜籽蛋白的疏水性

通过疏水性的变化能够较直观地反映分子表面疏水基团的变化，从而有助于了解蛋白质分子结构的改变。肽链空间结构的展开，亚基的解离，多聚体的形成均会对疏水性产生较大的变化。蛋白的疏水性与其乳化性、吸油性、溶解性等功能特性具有一定的相关性，因此有必要对热处理后菜籽蛋白的疏水性进行研究。

80℃热处理30 min，菜籽蛋白的疏水性降到最低值，然后迅速上升，60～120 min的疏水值变化不大。100℃热处理15～90 min疏水性一直下降，90 min后又迅速升高。造成这种现象的原因可能是加热初期菜籽蛋白由于疏水键及共价键（S-S）的形成发生了热聚集，屏蔽了菜籽蛋白的疏水区，使得与荧光探针结合的疏水基团减少，疏水性降低。随着热处理程度的增加，一方面聚集的肽链产生的空间排阻效应使得进一步释放出的疏水基团之间很难再结合，另一方面蛋白空间结构再次发生变化，部分亚基重新解离暴露出更多的疏水基团，疏水性重新升高。80℃和100℃热处理相比，两者的基本走势一致，但两者变化的拐点不同，这是由于温度的不同，导致相同的处理时间内，分子的受热程度不同。

2.3 热处理对菜籽蛋白吸油性的影响

吸油性是指菜籽蛋白吸收油脂的能力。影响蛋白质吸油性的因素是蛋白质的构象和蛋白质之间的反应。研究菜籽蛋白的吸油性对于菜籽榨油生产工艺、饲料生产中脂肪添加工艺具有重要的意义。影响因素主要有蛋白质的加工工艺、粒度大小、温度及所用油脂等。

图3 菜籽蛋白的吸油性

图3显示，菜籽蛋白在80℃和100℃的处理条件下，其吸油性随加热时间的变化趋势基本一致，均是先下降后上升，这与菜籽蛋白疏水性的变化趋势基本一致。加热初期，由于疏水键、S-S等产生大量的聚集体，一方面聚集体的生成包埋了部分亲油集团，减少了蛋白与油脂的结合，另一方面增大了蛋白的粒度，不利于分散蛋白迅速扩散到油脂界面，使得吸油性下降；随着加热时间的延长，肽链结构重新展开，甚至断裂，从而暴露更多的亲油基团，使得吸油性有所升高，另外菜籽蛋白中还具有一定含量的纤维素等物质，对其吸油性也会产生一定的影响。

在0～30 min的加热时间内，80℃热处理和100℃处理两者的吸油性差别较小，60～120 min处理组吸油性差距逐渐增大。可见过度的加热会对菜籽蛋白的吸油性造成较大的影响。

2.4 热处理对菜籽蛋白乳化性及乳化稳定性的影响

图4 菜籽蛋白的吸油性

蛋白质的乳化性及乳化稳定性与分子的柔顺性及疏水性有关[14]。疏水性的提高，能够加快蛋白质分子向界面的移动，好的柔顺性有助于分子在界面的重排。

图4显示，随着热处理时间的延长，菜籽蛋白的乳化性先是缓慢增加，之后又迅速下降，与疏水性的变化趋势并非一致，甚至相反，这与刘岩[15]等的研究结果相一致。造成这种结果的原因可能是分子的柔顺性发生了变化。与对照组相比，80℃处理15～60 min，100 ℃处理15～30 min，虽然疏水性降低，但菜籽蛋白经过适度的热处理分子的柔顺性升高，利于蛋白质迅速扩散而降低油/水界面的自由能，因而乳化性升高。而过度的热处理，虽然使疏水性升高，但大的聚集体降低了分子的柔顺性，使得乳化性降低。另外糖基化反应也会影响蛋白的乳化特性[16-17]。Kato等利用6-磷酸葡萄糖与卵白蛋白发生糖基化反应，可使卵白蛋白的乳化性提高5倍[18]。由于碱提蛋白的纯度只有80%左右，里面还具有一定的糖类。因此，关于热处理后菜籽蛋白乳化性的变化因素还有待于进一步的剖析。

热处理对菜籽蛋白的乳化稳定性影响较大，两种热处理下乳化稳定性迅速下降，到达一定程度之后，不再降低。而高温热处理对其乳化稳定性破坏更大。

2.5 热处理对菜籽蛋白溶解度的影响

图5 菜籽蛋白的溶解度曲线（80℃）

图6 菜籽蛋白的溶解度曲线（100℃）

由图5、图6可知，碱提酸沉法制取的菜籽蛋白的溶解度普遍较低，不超过60%，这与成兰英[19]所报道的相一致。在pH值4～6范围内，溶解度变化不大，均低于15%。这是由于菜籽蛋白较宽的等电点区域所致。越是远离等电点，热处理对菜籽蛋白溶解度的影响则越大。80℃热处理组，在pH值2～4及pH值6～10之间溶解度呈递减趋势，但变化幅度相对较小。而100℃热处理组，在pH值2～4及pH值6～10之间，溶解度先是迅速降低，之后趋于平缓。这是由于温度的不同使得蛋白分子热变性的程度迥异所致。加热初期，菜籽蛋白中的非球蛋白组分由于热稳定性较差，会急剧变性，生成大量的不溶性聚集及可溶性聚集体使得菜籽蛋白的溶解度迅速下降，继续加热，由于疏水基团的相互排斥效应，及部分聚集的重新解离作用使得溶解度下降缓慢。

100℃热处理90 min和120 min时,从pH值2～10菜籽蛋白的溶解度低于10%，由此可见温度越高，处理时间越长对菜籽蛋白的溶解度破坏性越大。

2.6 热处理对菜籽蛋白体外消化率的影响

图7 菜籽蛋白的消化率（80℃）

消化率表征了动物对蛋白的利用率。本实验采用胃蛋白酶-胰蛋白酶两步消化法对热处理后的菜籽蛋白进行消化实验，结果如图7所示。经过热处理之后的菜籽蛋白在胃蛋白酶消化阶段和胰蛋白酶消化阶段，其氮释放量变化趋势基本一致：先是快速增加，而后趋于平缓。

胃蛋白酶消化阶段,80℃热处理15、30、60 min处理组与对照组相比，其氮释放量均高于对照组，这是因为适度的热处理使得菜籽蛋白的空间结构发生变化，肽链展开，暴露了更多的酶切位点，氮释放速率相对提高。王金梅等[17]实验结果表明12S球蛋白的α亚基较β亚基更易消化。80℃热处理15、30、60 min可能使12S部分解离，暴露出更多的α亚基。另一方面，据报道，蛋白的消化率与非蛋白成分具有一定的相关性，如类黄酮，酚酸类物质等。Guo等[20]研究了芸香苷对苦荞麦蛋白的胃蛋白酶体外消化率的影响。结果表明：芸香苷的添加能显著提高蛋白体外消化性。Venkatacha lam等[21]研究表明：酚类物质的含量对芸扁豆蛋白的消化率具有一定的降低作用。油菜籽含有一定的酚类物质，多以酚酸和缩合单宁的形式存在，其是否影响菜籽蛋白的消化率有待于进一步的研究。80℃热处理90、120 min及100℃热处理组的氮释放量均低于对照组。这是因为过度的热处理造成了大聚集体的生成，延长了酶作用的时间，从而降低了消化率。

图8 菜籽蛋白的消化率（100℃）

进入胰蛋白酶消化阶段,80℃热处理组其氮释放量均明显高于对照组,而100℃热处理15、30 min处理组的氮释放量也高于对照组。原因在于，热处理不仅使菜籽蛋白暴露出更多的酶切位点，而且使菜籽蛋白中的胰蛋白酶抑制因子失活，加速了胰蛋白酶与菜籽蛋白的反应速率，从而提高了其氮释放量。

3 结论

①DSC结果表明：菜籽蛋白中12S球蛋白的变性温度为81℃，2S清蛋白的变性温度为60℃，12S球蛋白的热稳定性要高于2S清蛋白。

②随着热处理时间的延长，菜籽蛋白的吸油性先降低后升高；蛋白的乳化性先升高后降低，而乳化稳定性则持续下降，最后趋于平稳；蛋白溶解性随着热处理时间的延长持续下降，100℃热处理90、120 min后随着pH值的变化溶解度几乎不发生变化；适度的热处理使得消化率有所提高，但过度的热处理则会造成大聚集体的生成，从而降低蛋白的消化率。